肿瘤的发生发展是一种多因素,多步骤的疾病,这其中包括癌基因的激活和抑癌基因的失活等多种机制的失调。胃癌是消化系统中一种常见的恶性肿瘤,2018年在全球造成超过100W的新发病例和约78W的死亡病例的出现,这使得它成为全球范围内第五大最常被诊断出的癌症以及癌症死亡的第三大主要原因。尽管我们在外科手术治疗及辅助放化疗方面取得了长足的发展,预后不良仍旧是胃癌的顽疾之一。活跃的增殖性、强烈的侵袭及转移性以及胃癌本身的高异质性都是造成胃癌难以治愈的重要因素。因此研究探索介导胃癌发生发展的分子机制以及细胞调节机制显得尤为重要。泛素化是蛋白质翻译后修饰的一种关键方式,它在真核细胞生物体内的诸多生物学过程中起着至关重要的调节作用,它可以参与调节细胞周期、基因转录、细胞增殖以及信号转导等多种生理过程。此外,泛素化的调控机制在肿瘤的发生发展中也起着至关重要的作用,多种癌基因亦或是抑癌基因的表达受到这种机制的监管。蛋白质泛素化降解的基本方式:泛素亦或是泛素样蛋白通过结合泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和决定底物特异性的泛素连接酶E3形成复合物,然后附着于特异性的底物,从而实现对底物的泛素化标记,然后再通过泛素蛋白酶体系统对底物完成最终的降解。NUB1(negative regulator of ubiquitin-like protein-1)是泛素化调控系统的负性调节因子,它的主要调节目标是一种高度保守的泛素样蛋白NEDD8,NUB1可以通过负性调节NEDD8与其靶蛋白的缀合系统来控制多种底物的泛素化降解。目前,已有许多研究证实,NUB1在诸多类型的癌症中均有异常的表达,例如肾癌、直肠癌和宫颈癌。但是它在胃癌中的表达情况以及调控机制,我们却知之甚少。转移是造成癌症相关死亡的主要原因,上皮-间质转化(EMT)程序的部分激活被认为是增加肿瘤启动和转移潜能的关键驱动器。包括胃癌在内,几乎所有肿瘤的恶性进展均与EMT密切相关。上皮细胞形态过渡到间充质细胞形态时,多种EMT相关标记物会随之发生改变,如上皮细胞形态标记物E-钙黏蛋白表达会下降,同时间充质细胞形态的相关标记物,特别是N-钙黏蛋白,波形蛋白以及基质金属蛋白酶的表达会升高。这些改变会进一步促进肿瘤的恶性进展。此外,多个信号通路的激活也会诱导EMT,包括经典WNT,TGF-β,NF-κB通路等等。泛素化机制可以参与调控这些通路中部分关键蛋白的表达。然而NUB1作为负性调控泛素化过程的关键转录因子,它对于胃癌的侵袭和EMT的调控作用,我们仍然是未知的。本研究中,基于116例术后胃癌患者的组织切片以及对应的癌旁组织切片的免疫组织化学染色结果,我们对比了NUB1蛋白在癌组织与癌旁组织中的表达情况,同时分析了NUB1蛋白表达与临床病理特征之间的关系。此外,结合网络在线数据库,包括蛋白质表达和mRNA表达两个层面在内,我们还分析了NUB1表达与患者预后的关系。另一方面,我们还通过体外的细胞实验,验证了过表达NUB1对于胃癌的恶性生物学行为的影响作用,包括增殖、迁移和侵袭。通过流式细胞术分析了它对细胞周期的调控作用,尤其是控制细胞周期G1/S期的过渡。利用实时定量PCR(RT-PCR)和蛋白质印迹实验分析了NUB1对于EMT部分关键指标和抑癌基因p27Kip1表达的调控作用。本次研究,我们重点讨论了NUB1的过表达如何调控胃癌的发生和进展以及对于胃癌上皮间质转化(EMT)的影响,这些新的发现可为NUB1在抗癌过程中充当新型药物的载体或是诊断标记物提供帮助。当然,根据组化实验的结果,NUB1蛋白的表达对于胃癌的临床意义也是重要新发现的一部分。鉴于NUB1在胃癌的发生发展上积极的抑癌作用,我们希望通过此项研究帮助科研工作者更好的认识胃癌的发病机制,也为临床上制定更加精准的抗肿瘤方案提供潜在的策略。第一部分NUB1蛋白在胃癌及癌旁样本中的表达情况的研究目的:探索胃癌及癌旁病理组织样本中NUB1蛋白表达的意义。材料和方法:利用免疫组化染色的方法,对116例胃癌及配对的癌旁样本的石蜡切片进行检测,分析了NUB1在癌与癌旁样本中的表达差异。基于患者病理样本的组化评分结果,通过卡方检验和斯皮尔曼相关性系数分析了NUB1表达与临床病理特征之间的关系。同时,结合在线数据库mRNA表达数据,采用Kaplan-Meier估计和Log-Rank检验的方法,我们在蛋白质水平和mRNA水平两个层面上分析了NUB1表达与患者预后的关系,同时,通过构建COX比例风险模型,基于单因素和多因素的分析模式,评价了NUB1表达对于胃癌患者预后的价值。最后,结合患者淋巴结检查的临床信息,分析了NUB1表达与患者淋巴结阳性率之间的关系。结果:免疫组化实验结果显示,相对于癌旁样本,NUB1在胃癌组织中表达下调。NUB1蛋白表达水平与患者肿瘤大小、Borrmann分型、淋巴结转移、淋巴管浸润、TNM分期以及患者生存状态密切相关。生存分析结果显示,无论在蛋白质表达水平,还是在mRNA表达水平,低表达NUB1的患者预后更差。同时结合COX多因素分析的结果,包括Borrmann分型和TNM分期在内,证实NUB1的表达与胃癌患者的预后显著相关,结果有统计学意义。此外,淋巴结阳性率的比较证实,低表达NUB1的患者相对于高表达NUB1的患者拥有更高的淋巴结阳性率。结论:NUB1在胃癌组织中的低表达以及它与临床病理特征之间的紧密联系提示NUB1对于胃癌的发生发展意义重大。生存分析结果提示NUB1表达与患者预后之间存在密切关联,同时预后的多因素分析结果证实NUB1的表达有成为胃癌患者独立预后因素的可能。最后,淋巴结阳性率的比较提示低表达NUB1的患者拥有更高的淋巴结转移的风险。第二部分细胞实验研究NUB1调控胃癌恶性表型的作用机制目的:探索体外NUB1对于胃癌恶性生物学行为的调控作用。材料和方法:NUB1过表达细胞模型通过慢病毒转染的方式进行构建,实时定量PCR(RT-PCR)和蛋白质印迹实验确定慢病毒的转染效率。利用CCK-8试剂盒检测NUB1对于胃癌细胞系增殖活性的影响。利用荧光激活细胞分选术(FACS)分析其对细胞周期的影响作用。体外细胞划痕实验和基质胶Transwell实验验证NUB1对癌细胞迁移和侵袭的影响,最后通过蛋白质印迹实验检测NUB1对于EMT相关指标蛋白和调控细胞周期的关键抑癌基因p27Kip1的调节作用。结果:体外细胞实验证实,过表达NUB1可以抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭等恶性表型。流式细胞术证实了过表达NUB1阻滞了细胞周期G1/S期的转变过渡。NUB1过表达增加了抑癌基因p27Kip1的蛋白表达水平。然而,实时定量RCR实验结果却显示,NUB1过表达并没上调p27Kip1的mRNA表达水平,对照组与试验组之间的差异无统计学意义。此外,蛋白质印迹实验表明,NUB1过表达上调了E-钙黏蛋白的表达,同时下调了N-钙黏蛋白、波形蛋白和基质金属蛋白酶2(MMP2)的表达。结论:过表达NUB1抑制了胃癌细胞在体外的增殖活性,并造成了细胞周期G1/S期的阻滞。同时,过表达NUB1上调了抑癌基因p27Kip1蛋白的表达,但是其mRNA表达没有显著变化。此外,过表达NUB1能够通过调控EMT相关蛋白的表达抑制胃癌细胞的迁移及侵袭的能力。