第一部分循环miRNA作为ALK阳性肺癌的诊断和预后标志物的研究背景微小RNA(microRNA,mi RNA)在人体体液内广泛存在,并且稳定表达。循环血中异常表达的miRNA可以作为肿瘤的早期诊断和疗效预测的潜在生物标记物。然而,miRNA与非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)基因重排之间的相关性尚无报道。本研究旨在探索ALK基因重排的晚期NSCLC患者循环血中miRNA有无异常表达及其异常表达情况,并探寻经克唑替尼治疗的ALK阳性晚期NSCLC患者治疗前血浆中miRNA水平与克唑替尼治疗疗效之间的相关性。进而,尝试探索经克唑替尼治疗的ALK阳性晚期NSCLC患者血浆中miRNA表达水平的动态变化与克唑替尼疗效及预后之间的相关性。方法1.采用microarray芯片法对3组人群(3例ALK阳性晚期NSCLC患者、3例ALK阴性晚期NSCLC患者、3例健康人)血浆样本进行检测,了解肺癌患者与健康人血浆中miRNA表达差异情况、ALK阳性晚期NSCLC患者与ALK阴性晚期NSCLC患者血浆差异miRNA表达情况。本研究全部入组患者ALK基因状态均采用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术检测。2.采用实时定量反转录聚合酶链式反应(real-time reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)法对5组人群(8例健康人、8例肺良性疾病患者、6例肺鳞癌患者、6例肺腺癌患者、6例肺小细胞癌患者)血浆样本进行检测,候选内参基因为文献中曾报道的12个内参基因(U6、5s rRNA、18s rRNA、RNU38B、RNU43、RNU44、RNU48、mi R-93-5p、miR-103-3p、miR-191-5p、miR-197-3p、miR-221-3p),采用geNorm和NormFinder软件分析,确定本研究的最佳内参基因。3.采用RT-qPCR法对ALK阳性晚期NSCLC患者(n=41)和ALK阴性晚期NSCLC患者(n=32)血浆样本进行检测,检测目标为microarray芯片法筛选出的血浆表达水平显著差异的miRNA,验证ALK阳性与ALK阴性晚期NSCLC患者血浆中显著差异表达的miRNA。4.通过受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)下面积(area under the curve,AUC)评估mi RNA对于ALK基因状态诊断的灵敏度和特异度,用约登指数确定最佳cut-off值、计算各miRNA及miRNA组合的阳性预测值(positive predictive value,PPV)和阴性预测值(negative predictive value,NPV)。5.采用miRDB、miRanda以及TargetScan网站对得到的目的miRNA进行靶基因预测,并通过KEGG pathway预测其相关的信号通路。6.采用Kaplan-Meier生存分析法分析ALK阳性NSCLC患者(n=31)克唑替尼治疗前血浆miRNA表达水平与克唑替尼无病进展时间(progression-free survival,PFS)之间的相关性,探寻对克唑替尼PFS有预测作用的miRNA,同时对相关临床病理特征进行多因素分析。7.采用RT-qPCR法对接受克唑替尼治疗的ALK阳性晚期NSCLC患者血浆miRNA表达水平进行动态检测,同时随访这些患者的疗效和PFS,探寻克唑替尼治疗过程中血浆miRNA动态变化与克唑替尼疗效及PFS之间的相关性。结果1.血浆mi RNA基因芯片分析结果示,在健康人血浆中可检测到更多miRNA,共检测到409个miRNA,而在ALK阳性NSCLC和ALK阴性NSCLC中,分别检测到116个miRNA和209个mi RNA。进一步分析,我们发现在ALK阳性NSCLC组和ALK阴性NSCLC组中,共有21个miRNA的表达水平存在显著差异(表达倍数>2或<0.5)。与ALK阴性NSCLC相比,在ALK阳性NSCLC组中,有7个miRNA表达上调、14个miRNA表达下调。2.内参基因筛选结果显示,采用geNorm软件分析示5s rRNA和18s rRNA最为稳定,而采用NormFinder软件分析示,内参基因稳定性从高到低依次为:5s rRNA、18s rRNA、U6、RNU43、miR-103-3p、miR-197-3p、miR-93-5p、RNU38B、RNU48、miR-191-5p、RNU44、miR-221-3p。因此,5s rRNA确定为本研究血浆内最稳定的内参基因。3.RT-qPCR实验结果显示,有3个mi RNA在ALK阳性NSCLC患者与ALK阴性NSCLC患者血浆中表达水平存在显著性差异,分别为miR-28-5p、miR-362-5p和miR-660-5p,p值分别为<0.0001、0.0091和0.0030,它们均在ALK阳性NSCLC血浆中显著下调。4.ROC曲线分析显示,血浆miR-28-5p、miR-362-5p和miR-660-5p诊断ALK基因状态的AUC分别为0.873(95%CI:0.795-0.952)、0.673(95%CI:0.549-0.796)和0.760(95%CI:0.649-0.870),而miR-28-5p+miR-362-5p+mi R-660-5p联合诊断ALK基因状态的AUC高于上述3个miRNA单独诊断的结果,AUC为0.876(95%CI:0.801-0.951)。血浆miR-28-5p、miR-362-5p和miR-660-5p对于ALK基因阳性的诊断灵敏度分别为65.8%、51.22%和63.41%,诊断特异度分别为96.88%、80.77%和83.87%,PPV分别为96.43%、80.77%和83.87%,NPV分别为68.89%、57.45%和64.29%。在这3个miRNA中,miR-28-5p的灵敏度、特异度、PPV和NPV均最高。5.miR-28-5p可能通过作用于靶基因GSK3B参与到ALK下游通路mTOR和PI3K-AKT中。miR-660-5p可能通过作用于靶基因Bcl-2、MDM2、IRS1和ECM参与到PI3K-AKT通路,作用于靶基因Elk-1、Rap1和CACN参与到MAPK通路,作用于靶基因IRS1和Rictor参与到mTOR通路。6.Kaplan-Meier生存分析显示,31例接受克唑替尼治疗的ALK阳性NSCLC患者的中位PFS为6.0个月(1.0-28.0个月)。miR-362-5p不同表达水平间克唑替尼PFS的差异有统计学意义,miR-362-5p低表达组的PFS更长(p=0.015),HR=0.285(95%CI:0.104-0.780)。克唑替尼治疗前血浆miR-362-5p表达水平对克唑替尼的PFS有预测作用。而血浆miR-28-5p和miR-660-5p的表达水平与PFS无显著相关性(p值分别为0.712、0.769)。7.采用Wilcoxon配对秩检验法分析克唑替尼治疗前后血浆中miRNA的表达水平变化。在19例患者中,16例患者克唑替尼疗效评价为部分缓解(partial response,PR),3例患者疗效评价为疾病进展(progressive disease,PD)。在16例PR患者中,93.75%(15/19)患者克唑替尼治疗后血浆中miR-660-5p水平升高(p=0.001)。而在3例PD患者中,没有观察到这种趋势。在克唑替尼治疗后,血浆中miR-28-5p和mi R-362-5p表达水平的变化与克唑替尼疗效间无相关性(p值分别为0.776和0.796)。结论1.通过血浆microarray芯片筛选,健康人比肺癌患者血浆中miRNA数量更多。在健康人、ALK阳性NSCLC和ALK阴性NSCLC血浆分别检测到409个miRNA、116个miRNA和209个miRNA。2.通过血浆microarray基因芯片在晚期NSCLC血浆中筛选出21个表达水平与ALK基因状态显著相关的miRNA,经过RT-qPCR验证表明,采用microarray基因芯片筛选血浆miRNA差异表达是一种可行、可靠的方法。3.在ALK阳性晚期NSCLC血浆中,miR-28-5p、miR-362-5p和miR-660-5p表达显著下调,通过AUC分析显示这3个miRNA及其组合均显示出较高的敏感度和特异度,表明血浆miRNA可作为潜在的NSCLC患者ALK基因重排诊断性生物标志物。4.克唑替尼治疗前血浆miR-362-5p表达水平对克唑替尼PFS有预测作用,miR-362-5p表达水平低的患者PFS更长。5.接受克唑替尼治疗的ALK阳性NSCLC血浆miR-660-5p表达水平与克唑替尼的疗效和PFS显著相关。在克唑替尼治疗过程中,血浆miR-660-5p表达水平升高提示克唑替尼治疗疗效好、PFS更长。血浆miRNA有望成为克唑替尼疗效预测标志物。第二部分克唑替尼治疗ALK阳性晚期非小细胞肺癌疗效的相关性分析背景ALK基因重排现象在NSCLC中的发生率约为3~7%。作为首个ALK抑制剂,克唑替尼在ALK基因阳性的晚期NSCLC治疗中占有重要地位。有关克唑替尼治疗疗效的数据多来自于国际多中心临床研究,其中,中国患者所占比例有限。专门针对中国肺癌患者克唑替尼治疗的研究尚少,克唑替尼治疗过程中颅内PFS与颅外PFS之间的相关性罕有报道。在中国ALK阳性NSCLC患者中,克唑替尼的治疗时机、人群选择、克唑替尼基线时有/无脑转移等对克唑替尼疗效的影响仍有待临床数据的验证。本研究旨在中国ALK阳性晚期NSCLC人群中观察克唑替尼的疗效、PFS和总生存期(overall survival,OS),分析克唑替尼给药时机、克唑替尼基线时有/无脑转移与PFS和OS的相关性,探索克唑替尼治疗过程中颅内PFS与系统PFS的相关性及影响因素。同时,通过Cox多因素分析,明确能预测克唑替尼PFS、OS的临床病理特征。方法本研究系单中心、回顾性、观察性研究,共纳入91名ALK阳性晚期NSCLC患者,根据患者病历资料获取临床信息,并通过门诊、电话完成随访。我们观察了整体客观缓解率(objective response rate,ORR)、疾病控制率(disease control rate,DCR)、PFS、OS。比较克唑替尼用于一线和多线治疗的ORR、DCR、PFS、OS间的差别,比较克唑替尼治疗基线时有/无脑转移对PFS和OS影响。在克唑替尼治疗过程中因脑转移而PD的患者中,观察其颅内PFS与系统性PFS,评估颅内PFS与系统性PFS之间的相关性。并采用Cox多因素分析,评估临床病理特征对PFS、OS的影响。结果1.全部91例ALK阳性晚期NSCLC患者,中位年龄48岁(24~77岁),男女患者分别为47.3%(43/91)和52.7%(48/91),PS评分均为0-1分。病理类型主要为腺癌(88/91,96.7%),组织分化程度主要为G3(36/91,39.6%)和Gx(43/91,47.3%),无或轻度吸烟史占91.2%(83/91),ALK基因检测主要采用FISH法(80/91,87.9%)。克唑替尼一线治疗28例(30.8%)、二线治疗30例(33.0%)、三线及三线以上33例(36.3%)。克唑替尼疗效评价,无患者完全缓解(complete response,CR),PR患者65例(71.4%)、疾病稳定(stable disease,SD)患者18例(19.8%)、PD患者8例(8.8%)。截止到末次随访日期,34例(37.4%)患者死亡,57例(62.6%)存活或失访。2.克唑替尼对ALK阳性晚期NSCLC患者的总体ORR为71.4%,DCR为91.2%。其中,一线接受克唑替尼治疗的患者28例,ORR为78.6%,DCR为96.4%,二线及二线以上接受克唑替尼治疗的患者63例,ORR为68.3%,DCR为88.9%,差异不具有统计学意义(p=0.445)。3.克唑替尼治疗ALK阳性晚期NSCLC的中位PFS为9.5个月(1.0~65.0个月),中位OS为45.0个月(6.0~84.0个月)。4.克唑替尼基线时有脑转移患者33例(36.3%),无脑转移患者58例(63.7%)。克唑替尼治疗基线时脑转移组和无脑转移组的中位PFS分别为11.0个月和9.0个月(p=0.9106),中位OS分别为45.0个月和44.0个月(p=0.6695)。5.克唑替尼一线治疗中位PFS为18.0个月,多线治疗中位PFS为8.0个月,HR=0.5701(95%CI:0.3340-0.9450),p=0.0293。克唑替尼一线治疗中位OS尚未达到,二线及二线以上治疗中位OS为44.0个月,HR=0.7367(95%CI:0.3262-1.664),p=0.4623。6.在58例克唑替尼治疗基线无脑转移患者中,有20例在克唑替尼治疗过程中出现脑转移而PD,其中,有12例患者先出现颅内PD,后出现颅外PD,其余8例患者为颅内、颅外同步PD。在克唑替尼治疗过程中出现脑转移的患者均接受了脑转移灶局部放疗,中位系统性PFS为10.0个月(95%CI:7.61~23.56个月),中位颅内PFS为4.5个月(95%CI:1.96~14.54个月),中位扩展PFS(系统性PFS与颅内PFS的差值)为6.5个月(95%CI:3.53~11.14个月)。颅内PFS与扩展PFS之间无显著相关性(p=0.906)。7.多因素分析显示,克唑替尼治疗时机越早,PFS越长,HR=2.357(95%CI:1.208-4.598,p=0.012)。其余临床病理特征与克唑替尼PFS、OS无显著相关性(p>0.05)。结论1.在ALK阳性晚期NSCLC患者中,年轻、腺癌、不吸烟患者所占比例较高。2.克唑替尼对ALK阳性晚期NSCLC患者的总体ORR为71.4%,DCR为91.2%。克唑替尼用于一线治疗ORR和DCR优于多线治疗,但差异无统计学意义。3.克唑替尼治疗ALK阳性晚期NSCLC的中位PFS为9.5个月,中位OS为45.0个月。4.克唑替尼基线时有或无脑转移对克唑替尼PFS及OS无显著性影响。5.克唑替尼治疗线数对于克唑替尼PFS显著相关,治疗时机越早,PFS越长,一线治疗的中位PFS比多线治疗延长10.0个月。治疗时机对OS无显著影响。6.在克唑替尼治疗过程中出现脑转移的患者,中位系统性PFS为10.0个月,中位颅内PFS为4.5个月,中位扩展PFS为6.5个月。颅内PFS与扩展PFS之间无显著相关性,颅内PFS无法预测扩展性PFS。7.多因素分析显示,克唑替尼治疗时机越早、PFS越长。