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目的探究Nerostatin-1(Nec-1)介导的自噬流在高糖培养大鼠心肌成纤维细胞致纤维化中的作用。方法体外培养原代大鼠心肌成纤维细胞,分别置于正常糖(5.5 m M)或高糖(25 m M)的DMEM培养基中。(1)将细胞随机分为4组:正常糖组(NG组)、高糖组(HG组)、高糖+DMSO组(HG+DMSO组)、高糖+Nec-1组(HG+Nec-1组),其中HG+Nec-1组又分为3个浓度亚组,Nec-1分别以浓度1μM、10μM、100μM对细胞进行处理48 h。(2)将细胞随机分为4组:正常糖组(NG组)、正常糖+氯喹组(NG+CQ组)、高糖组(HG组)、高糖+氯喹组(HG+CQ组),单用氯喹(CQ)以25μM浓度对细胞进行处理24 h。(3)将细胞随机分为5组:高糖组(HG组)、高糖+DMSO组(HG+DMSO组)、高糖+Nec-1组(HG+Nec-1组)、高糖+氯喹组(HG+CQ组)、高糖+Nec-1+氯喹组(HG+Nec-1+CQ组),即在用Nec-1(10μM)处理细胞24 h的基础上,加入氯喹(25μM继续处理24 h)。采用Elisa法以及细胞免疫荧光法检测胶原蛋白I和III的表达;免疫共沉淀(Co-IP)法检测坏死性凋亡相关蛋白RIP1与RIP3的结合水平;Western bolt法检测自噬流相关蛋白P62、LC3 II/I的表达;双荧光m RFP-GFP-LC3质粒转染检测自噬流中自噬小体的变化;Acridine orange(AO)荧光染色检测自噬流中溶酶体功能的变化。结果与NG组比较,HG组胶原蛋白I和III表达上调(P<0.05),RIP1与RIP3的结合水平以及P62、LC3 II/I蛋白表达上调(P<0.05);与HG组比较,HG+Nec-1组胶原蛋白I和III表达下调(P<0.05),RIP1与RIP3的结合水平以及P62、LC3 II/I蛋白表达下调(P<0.05);Nec-1三个浓度间的胶原蛋白分泌和蛋白表达差异无统计学意义(P(29)0.05);DMSO作为Nec-1的溶剂对蛋白表达无影响(P(29)0.05)。与NG组比较,NG+CQ组P62和LC3 II/I蛋白表达上调(P<0.05);与HG组比较,HG+CQ组P62和LC3 II/I蛋白表达上调(P<0.05)。与HG组比较,HG+Nec-1组胶原蛋白I和III以及P62、LC3 II/I蛋白表达下调,m RFP-GFP-LC3质粒转染显示HG+Nec-1组自噬流中的自噬小体清除顺畅,AO荧光染色显示HG+Nec-1组自噬流中的溶酶体功能恢复(P<0.05);与HG+Nec-1组比较,HG+Nec-1+CQ组胶原蛋白I和III以及P62、LC3 II/I蛋白表达上调,m RFP-GFP-LC3质粒转染显示HG+Nec-1+CQ组自噬流中的自噬小体又重新蓄积,AO荧光染色显示HG+Nec-1+CQ组自噬流中的溶酶体功能被破坏(P<0.05);DMSO作为Nec-1的溶剂对蛋白表达、自噬小体清除以及溶酶体功能无影响(P(29)0.05)。结论Nec-1可减轻高糖培养下大鼠心肌成纤维细胞纤维化的程度,其作用机制可能与降低RIP1与RIP3的结合水平,减少高糖所致的自噬小体蓄积,修复自噬流损伤,从而发挥心肌保护作用有关。