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研究背景:LKBl/STKll(serine theronine protein kinasell)基因为1998年从Peutz-Jeghers综合征(黑色素斑—胃肠多发性息肉综合征,PJS)患者中鉴定的一种抑癌基因。关于抑癌基因在肿瘤发生发展中的作用,已有大量的研究报道。有研究显示,LKBl基因突变可造成胚胎血管发育的异常,且上调胚胎纤维母细胞中血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达;在肺癌的脑转移标本中,58%的患者出现LKBl基因的杂合型缺失。由此推测,抑癌基因LKBl可能通过调控VEGF的表达而对肿瘤细胞的生长和转移有一定的作用。肿瘤的生长与转移有赖于新生血管的形成,且肿瘤细胞本身在代谢的过程中亦分泌VEGF并表达其受体,加速肿瘤新生血管的形成。作为一个新发现的抑癌基因,LKBl在肿瘤生成和恶性转化中的作用,国内外报道很少。因此,研究抑癌基因LKBl对肿瘤细胞中VEGF等基因的表达及其调控机制对于阐明恶性肿瘤生长和转移具有重要意义。 目的:通过RNA干扰技术构建LKBl沉默的肺癌细胞模型,在这些细胞模型基础上探讨LKBl基因在肺癌发生、发展中的作用及其可能机制。 方法:将脂质体转染体系介导的SiRNA-LKBl转入高表达LKBl基因的95D细胞,通过筛选得到稳定转染的细胞系,然后应用这些细胞系进行研究。应用细胞计数法绘制细胞生长曲线和流式细胞仪检测细胞周期的变化,分析LKBl基因沉默对肺癌细胞生物学行为的影响。为了了解LKBl基因对肺癌细胞中VEGF的调控作用和其可能的机制,本实验用双荧光素酶化学发光法和生物信息学的启动子预测软件分析和检测VEGF启动子活性区域,用RNA干扰技术和RT-PCR等方法检测LKBl沉默后的大肺癌细胞95D中的SPl和VEGF的表达变化。进一步应用SEAP质粒检测报告系统对LKBl调控相关的信号通路、基因及其转录因子进行了研究,用Western blotting及Northern blotting等核酸分子杂交技术检测相关基因在蛋白和RNA水