目的组织金属蛋白酶抑制因子-3（tissue inhibitor of metalloproteinase-3,TIMP-3）在胰腺癌的发生和发展中起着重要的作用。但是,TIMP-3 N端结构域（N-TIMP3）蛋白对胰腺癌的作用还不清楚。本课题拟构建与鉴定N-TIMP3重组腺病毒载体,为以后深入研究N-TIMP3对胰腺癌的作用奠定基础。另外,还拟构建与鉴定增强型绿色荧光蛋白（enhanced greenfluorescent protein,EGFP）重组腺病毒载体,作为重组腺病毒载体构建过程中的系统阳性对照。方法分别将编码N-TIMP3与EGFP的DNA片段定向克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV,构建重组穿梭质粒pShuttle-N-TIMP3与pShuttle-EGFP。将上述穿梭质粒PmeⅠ线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组,构建重组腺病毒载体pAd-N-TIMP3与pAd-EGFP。分别将PacⅠ线性化的重组腺病毒载体转染QBI-293A细胞,获得重组腺病毒Ad-N-TIMP3与Ad-EGFP。上述重组腺病毒经过两次感染QBI-293A细胞而扩增后,用半数组织培养感染剂量(tissue culture infectious dose 50,TCID₅₀)法检测滴度。最后,将重组腺病毒Ad-N-TIMP3与Ad-EGFP分别感染胰腺癌细胞系PANC-1细胞后,通过Western blot的方法检测TIMP-3 N端结构域蛋白的表达,以及通过荧光倒置显微镜检测绿色荧光蛋白的表达。结果穿梭质粒pShuttle-N-TIMP3与pShuttle-EGFP经过鉴定,被确认成功构建;相应的重组腺病毒载体pAd-N-TIMP3与pAd-EGFP经过鉴定,也被确认成功同源重组。将上述重组腺病毒载体分别转染QBl-293A细胞,能够观察到细胞致病变效应（cytopathic effect,CPE）。重组腺病毒Ad-N-TIMP3与Ad-EGFP经两次扩增后,滴度分别达到5×10⁸PFU/ml与8×10⁸PFU/ml。最后,将重组腺病毒Ad-N-TIMP3与Ad-EGFP分别感染胰腺癌细胞系PANC-1细胞,能够检测到目的蛋白的表达。结论本实验成功地构建了复制缺陷型重组腺病毒载体pAd-N-TIMP3与pAd-EGFP（后者为系统阳性对照）,并检测到目的蛋白的表达,为以后深入研究N-TIMP3对胰腺癌的作用,以及探讨N-TIMP3转基因治疗胰腺癌的可能性奠定了基础。