弓形虫是细胞内寄生原虫,可感染多种动物,能够引起绵羊的流产和死胎,人亦可感染,可导致流产和先天性感染,同时是导致免疫缺陷病人死亡的一种重要病原。目前,绵羊的弓形虫病可利用弱毒苗进行防控,但人类尚未有合适的疫苗。因此,弓形虫疫苗的研发在世界各地,尤其是在该病的高发地区,如美国南部地区,和其他一些缺乏有效治疗药物的地区备受重视。在弓形虫生活过程中,需要抗氧化酶谷胱甘肽还原酶(TgGR)和谷胱甘肽-S-转移酶(TgGST)以及参与糖酵解和能量生成的酶脱氧核糖磷酸醛缩酶(TgDPA)和苹果酸脱氢酶(TgMDH)]。本文对这些酶基因进行了克隆、序列分析、原核表达,并构建DNA疫苗,研究其免疫效果。本研究主要包括以下几部分：1、TgDPA, TgGR, TgGST和TgMDH基因的克隆和序列分析利用一步法提取弓形虫速殖子的RNA,并将其反转录成cDNA,作为扩增TgDPA, TgGR, TgGST和TgMDH基因的模板。根据GenBank中的目的序列设计四种基因的特异性引物,并分别添加限制性内切酶酶切位点。然后进行PCR反应,并将扩增产物回收纯化,连接到pMD-18T载体上,而后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。用限制性内切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切鉴定不同基因的阳性克隆,通过序列测定和生物信息学分析进一步鉴定重组子。四个基因的生物信息学分析结果如下：TgDPA基因的ORF为789bp,编码262个氨基酸的蛋白,分子量大约为27kDa。TgGRORF 1518bp,翻译出505个氨基酸,蛋白分子量约54kDa. TgGST (1056bp)基因编码的蛋白约为39kDa,包含351个氨基酸；基因TgMDH (949bp)包含316个氨基酸,蛋白大小约为34kDa。2、TgDPA, TgGR, TgGST和TgMDH基因的原核表达和抗血清制备为了获得重组蛋白TgDPA, TgGR, TgGST和TgMDH,首先利用限制性内切酶BamHI和Hind Ⅲ酶切获得基因,回收之后亚克隆到pET28a载体上,转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导表达蛋白。结果发现这四种蛋白均以包涵体形式表达。经SDS-PAGE鉴定发现四个蛋白大小分别为27kDa (DPA)、54kDa (GR)、39kDa (GST)和34kDa (MDH)。将重组蛋白经过一系列的变性和复性,用纯化的重组蛋白免疫大鼠,以制备rTgDPA rTgGR、rTgGST和rTgMDH抗血清。免疫结束后,采血、分离血清,然后用western blot验证抗血清的特异性。结果显示这四种重组蛋白都能刺激大鼠的免疫系统,诱导抗体产生。3、TgDPA, TgGR, TgGST和TgMDH核酸疫苗的免疫保护性试验本课题将四个基因分别构建核酸疫苗,研究其免疫保护性。结果显示,免疫组小鼠均产生了高效价的抗体,能够刺激机体的体液免疫应答；在细胞因子方面,注射TgDPA, TgGR, TgGST和TgMDH后,IFN-γ, IL-4和IL-17的分泌水平显著上升(p<0.05),然而细胞因子TGF-β1在TgGST免疫组和TgMDH免疫组无明显变化,TgDPA组在二次免疫后TGF-β1的分泌显著下降(p<0.05),TgGR组在二次免疫后TGF-β1的分泌水平显著上升(p<0.05)。本实验也对小鼠感染弓形虫后细胞免疫应答水平进行了检测。通过流式技术检测CD4+, CD8+T细胞和MHC类分子的变化。结果表明,TgDPA和TgMDH在诱导T细胞向CD4+, CD8+T细胞分化方面效果均十分显著,而TgGR组主要引起以CD4+T细胞为主的细胞免疫应答,而TgGST组主要引起以CD8+T细胞为主的细胞免疫应答。在感染弓形虫强毒株RH(2×104/只)后,对照组小鼠在感染后8-10内全部死亡,而疫苗组的存活时间显著增加,其中TgDPA组存活20天,TgGR组15天,TgGST组14天,TgMDH组17天。结果表明刚地弓形虫抗氧化酶基因和糖酵解酶基因构建的DNA疫苗可显著增强机体的体液免疫和细胞免疫应答,并对弓形虫的急性感染具有部分免疫保护作用。