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菊粉酶在食品、医药、以及能源工业中有着广阔的应用前景,对菊芋块茎等富含菊糖作物的深加工有着重要的意义。本实验以一株具有较强产酶能力的丝状真菌微紫青霉为出发菌株,从中克隆到外切菊粉酶基因,将该基因在毕赤酵母表达系统中进行了高效表达。通过将外切菊粉酶基因在工业乙醇发酵菌株酿酒酵母中表达,构建了能够一步利用菊粉发酵乙醇的工程菌株。具体的研究内容如下：(1)通过设计简并引物从微紫青霉中扩增到了菊粉酶基因的片段,使用RACE技术扩增到了外切菊粉酶基因inuAl的全长,共2115bp,有67bp的内含子,编码704个氨基酸。菊粉酶前体肽氨基酸的N端具有20个氨基酸残基的信号肽,有7个可能的糖基化位点。分析前体肽的保守序列,推测N端40至300AA之间具有糖苷酶32家族的特性。(2)构建pPICZaC-INUB表达载体,将克隆得到的菊粉酶基因inuAl在Pichia pastoris X33中进行高效表达,获得重组子R32,在1%的甲醇诱导下,5d后重组子R32的发酵液上清的酶活为278.2U/mL,是出发菌株的11倍,该重组菌株具有工业生产的潜力。通过亲和层析纯化重组菊粉酶,并通过western-blot和质谱鉴定确认纯化蛋白为目标蛋白,重组蛋白的分子量约为100kDa。纯化后的菊粉酶仍然具有较高的菊粉酶活性,在食品和医药行业具有潜在应用价值。研究了纯化后蛋白的性质,重组菊粉酶的最适温度和pH分别为50℃和4.5,在低于40℃和较宽的pH范围内酶较稳定,Ca2+对重组菊粉酶有激活的作用,而大多数金属离子抑制了菊粉酶的活性。酶活同时被一些蛋白抑制剂如PMSF、SDS等的抑制。通过薄层层析考察菊粉酶对底物的水解作用,发现产物主要为果糖,进一步验证重组蛋白为外切型菊粉酶。(3)酿酒酵母6525能够利用果糖生产高浓度的乙醇,为了能使该酵母一步利用菊粉生产乙醇,构建了菊粉酶基因表达载体pUG-PICS,使用组成型的启动子PGK1。将表达载体pUG-PICS与酵母的18SrDNA同源重组将菊粉酶基因整合到酿酒酵母的基因组DNA上,获得了能够表达菊粉酶基因的重组子BR8,BR8能够直接利用菊粉发酵生产乙醇,在100mL的体系中,发酵5d后培养基中乙醇的量为9.5%(v/V),而没有转入菊粉酶的酿酒酵母6525,只能利用菊粉中的部分还原糖,最高只能生成3.3%(v/v)乙醇。用5L的发酵罐进一步放大发酵体系,乙醇的产量达到14.0%(v/v),糖醇转化率达到94.5%。发酵培养基中的菊粉大部分都转化为了乙醇、CO2和细胞生物量。细胞干重在发酵6d后为11.9g/L。(4)由于转化子BR8的菊粉酶活力偏低,另外使用了酿酒酵母2805和BY4747表达了菊粉酶基因,获得重组子AR34和R5,重组菊粉酶酶活分别为4.4U/mL和4.5U/mL。利用重组子AR34和R5分别协同6525发酵菊粉生产乙醇,发现菊粉酶活力的增加有利于提高乙醇的产量。在100mL的发酵体系中,乙醇的浓度分别为11.0%v/v和10.8%v/v。