研究目的:原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,其中肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma)是原发性肝癌中最常见的类型,死亡率在恶性肿瘤中居第二位。血管生成拟态(vasculogenic mimicry)是一种由肿瘤细胞包围的血液供应模式,增加了患者不良预后和肿瘤转移的可能性。长链非编码RNA n339260(lnc RNA n339260)在先前的研究中发现是能够促进肿瘤血管生成拟态(VM)形成的因子,并且发现有6个mi RNA分别是mi RNA29b-1-5p、mi RNA30e-5p、mi RNA31-3p、mi RNA92a-1-5p、mi RNA519c-5p、mi RNA520c-5p,这6个mi RNAs可能与lnc RNA n339260之间存在相互作用关系,但是具体的作用机制并未阐述。本研究探讨了lnc RNA n339260在肝细胞肝癌中VM形成的分子机制,为肝细胞肝癌的诊断和靶向治疗提供了新的思路。研究方法:1.收集天津医科大学肿瘤医院高级医师诊断的104例肝细胞肝癌患者的冰冻组织。实时荧光定量聚合酶链式反应(q RT-PCR)用于检测人体肝细胞肝癌冰冻组织中lnc RNA n339260和mi RNAs的表达情况。从中选出差异表达最强的mi RNA即mi RNA30e-5p并且分析二者与患者临床病理资料之间的关系。通过Spearman相关性分析验证lnc RNA n339260和mi RNA30e-5p的关系。同时采用Kaplan-Meier法对lnc RNA n339260和mi RNA30e-5p进行生存分析。2.收集天津医科大学肿瘤医院高级医师诊断的104例肝细胞肝癌患者石蜡组织切片。通过免疫组织化学的方法观察组织中MMP2、MMP9、VE-Cadherin、E-Cadherin、Vimentin、Snail的表达情况,再通过CD31/PAS双染的方法观察组织中VM的存在情况,并且进行临床病理资料分析,同时采用Kaplan-Meier法对MMP2、MMP9、VE-Cadherin、E-Cadherin、Vimentin、Snail和VM进行生存分析。结合前面q RT-PCR的实验结果通过卡方检验分析lnc RNA n339260、mi RNA30e-5p和MMP2、MMP9、VE-Cadherin、E-Cadherin、Vimentin、Snail、VM之间的差异,用Pearson相关性分析分析lnc RNA n339260、mi RNA30e-5p和MMP2、MMP9、VE-Cadherin、E-Cadherin、Vimentin、Snail、VM之间的的相关性。3.在高侵袭性和低侵袭性肝癌细胞系中各选择一个细胞,分别进行lnc RNA n339260上调和下调的质粒转染,并且用q RT-PCR检验转染效果,然后建立稳转细胞系。通过划痕实验、迁移实验、侵袭实验、MTT以及体外三维培养实验观察lnc RNA n339260对HCC细胞伤口愈合、迁移、侵袭、增殖及管道形成能力的影响。通过Western Blot分别检测EMT、VM相关分子和转移有关分子的表达情况。4.在选用的肝癌细胞系中,分别进行mi RNA30e-5p上调和下调的质粒转染,并且用q RT-PCR检验转染效果,然后建立稳转细胞系。通过划痕实验、迁移实验、侵袭实验、MTT以及体外三维培养实验观察mi RNA30e-5p对HCC细胞伤口愈合、迁移、侵袭、增殖及管道形成能力的影响。通过Western Blot分别检测EMT、VM相关分子和转移有关分子的表达情况。5.应用荧光素酶报告基因实验验证lnc RNA n339260和mi RNA30e-5p之间的关系。将lnc RNA n339260和mi RNA30e-5p的质粒进行共转染以建立稳转细胞系。通过划痕实验、迁移实验、侵袭实验、体外三维培养实验以及Western Blot观察二者之间相互作用关系。6.通过Target Scan.Pic Tar和mi RDB数据库预测所筛选的mi RNA30e-5p下游的靶基因即TP53INP1。此外,mi RNA30e-5p和TP53INP1通过荧光素酶报告基因实验证明二者能够直接结合。随后将mi RNA30e-5p和TP53INP1的质粒进行共转染,建立稳转细胞系。通过划痕实验、迁移实验、侵袭实验、体外三维培养实验以及Western Blot观察二者之间相互作用关系。7.收集天津医科大学肿瘤医院高级医师确诊的104例的肝细胞肝癌患者石蜡组织切片,用免疫组织化学染色法观察TP53INP1在肝细胞肝癌组织中的表达情况。并且分析TP53INP1的表达与MMP2、MMP9、VE-Cadherin、E-Cadherin、Vimentin、Snail、VM之间的差异。同时用Pearson相关性分析分析TP53INP1与MMP2、MMP9、VE-Cadherin、E-Cadherin、Vimentin、Snail、VM之间的相关性。采用Kaplan-Meier法分析患者TP53INP1表达情况对生存时间的影响,并且进行临床病理资料分析。最后,结合前面q RT-PCR的实验结果通过卡方检验分析lnc RNA n339260、mi RNA30e-5p和TP53INP1之间的差异,用Pearson相关性分析分析lnc RNA n339260、mi RNA30e-5p和TP53INP1之间的的相关性。8.在前面建立的lnc RNA n339260和mi RNA30e-5p上调、下调的稳转细胞系中通过Western Blot检测TP53INP1的表达情况。9.在选用的肝癌细胞系中,分别进行TP53INP1上调和下调的质粒转染,并且用Western Blot检验转染效果,然后建立稳转细胞系。通过划痕实验、迁移实验、侵袭实验、MTT以及体外三维培养实验观察TP53INP1对HCC细胞伤口愈合、迁移、侵袭、增殖及管道形成能力的影响。通过Western Blot分别检测EMT、VM相关分子、转移有关分子和TP53INP1的表达情况。研究结果:1.肝癌组织中lnc RNA n339260的表达显著高于癌旁组织。mi RNA29b-1-5p、mi RNA30e-5p、mi RNA520c-5p的表达明显低于癌旁组织,mi RNA31-3p、mi RNA92a-1-5p、mi RNA519c-5p在HCC组织和癌旁组织中表达没有显著差异。Spearman相关性分析得到lnc RNA n339260和mi RNA30e-5p的表达呈负相关(r=-0.299,P=0.002)。而mi RNA29b-1-5p、mi RNA520c-5p与lnc RNA n339260的表达之间没有相关性。高表达lnc RNA n339260的患者的平均存活时间短于低表达的患者。高表达mi RNA30e-5p的患者的平均生存时间长于低表达的患者。二者的表达与患者的年龄、TNM分期、肿瘤大小、组织学分级无关,与肿瘤的转移有关(P<0.05)。2.在HCC石蜡切片中,癌组织中MMP2、MMP9、VE-Cadherin、Vimentin、Snail的表达高于癌旁组织,E-Cadherin在癌组织中的表达低于癌旁组织,癌组织中存在VM的例数多于癌旁组织中存在VM的例数。同时MMP2、MMP9、VE-Cadherin、E-Cadherin、Vimentin、Snail的表达和VM的存在与患者的年龄、TNM分期、肿瘤大小、组织学分级没有明显关系,与肿瘤的转移有关(P<0.05)。MMP2、MMP9、VE-Cadherin、Vimentin、Snail阳性表达的患者生存时间明显短于阴性表达的患者,E-Cadherin阳性表达的患者生存时间明显长于阴性表达的患者。lnc RNA n339260的表达与MMP2、MMP9、VE-Cadherin、Vimentin、Snail的表达和VM的存在呈正相关关系,与E-Cadherin的表达呈负相关关系。mi RNA30e-5p的表达与MMP2、MMP9、VE-Cadherin、Vimentin、Snail的表达和VM的存在呈负相关关系,与E-Cadherin的表达呈正相关关系。3.选择高侵袭性的HCCLM3细胞和低侵袭性的Hep G2细胞,建立lnc RNA n339260的上调和下调的稳转细胞系。实验结果显示上调lnc RNA n339260的HCCLM3细胞和Hep G2细胞伤口愈合能力、迁移能力、侵袭能力、增殖能力以及成管能力较对照组明显增强(P<0.05)。同时,下调lnc RNA n339260的HCCLM3细胞和Hep G2细胞伤口愈合能力、迁移能力、侵袭能力、增殖能力以及成管能力较对照组明显减弱(P<0.05)。在上调lnc RNA n339260的HCCLM3细胞和Hep G2细胞的中MMP2、MMP9、VE-Cadherin、Vimentin、Snail的表达较对照组明显增多而E-Cadherin的表达明显减弱(P<0.05)。在下调lnc RNA n339260的HCCLM3细胞和Hep G2细胞的中MMP2、MMP9、VE-Cadherin、Vimentin、Snail的表达较对照组明显减少而E-Cadherin的表达明显增强(P<0.05)。4.选择高侵袭性的HCCLM3细胞和低侵袭性的Hep G2细胞,建立mi RNA30e-5p的上调和下调的稳转细胞系,实验结果显示上调mi RNA30e-5p的HCCLM3细胞和Hep G2细胞伤口愈合能力、迁移能力、侵袭能力、增殖能力以及成管能力较对照组明显减弱(P<0.05)。同时,下调mi RNA30e-5p的HCCLM3细胞和Hep G2细胞伤口愈合能力、迁移能力、侵袭能力、增殖能力以及成管能力较对照组明显增强(P<0.05)。在上调mi RNA30e-5p的HCCLM3细胞和Hep G2细胞的中MMP2、MMP9、VE-Cadherin、Vimentin、Snail的表达较对照组明显减少而E-Cadherin的表达明显增强(P<0.05)。在下调mi RNA30e-5p的HCCLM3细胞和Hep G2细胞的中MMP2、MMP9、VE-Cadherin、Vimentin、Snail的表达较对照组明显增多而E-Cadherin的表达明显减弱(P<0.05)。5.荧光素酶报告基因实验中mi RNA30e-5p可与lnc RNA n339260直接结合。lnc RNA n339260上调和mi RNA30e-5p上调的HCCLM3细胞和Hep G2细胞的伤口愈合能力、迁移能力、侵袭能力以及成管能力比lnc RNA n339260上调和mi RNA30e-5p对照的HCCLM3细胞和Hep G2细胞弱。相反,lnc RNA n339260下调和mi RNA30e-5p下调的HCCLM3细胞和Hep G2细胞的伤口愈合能力、迁移能力、侵袭能力以及成管能力比lnc RNA n339260下调和mi RNA30e-5p对照的HCCLM3细胞和Hep G2细胞强。在Western Blot实验中,观察到lnc RNA n339260上调和mi RNA30e-5p上调的HCCLM3细胞和Hep G2细胞中VE-Cadherin、Vimentin、Snail、MMP2、MMP9的表达比lnc RNA n339260上调和mi RNA30e-5p对照的HCCLM3细胞和Hep G2细胞弱而E-Cadherin的表达结果相反。同理,lnc RNA n339260下调和mi RNA30e-5p下调的HCCLM3细胞和Hep G2细胞中出现相反的结果。6.通过Target Scan.Pic Tar和mi RDB数据库预测所筛选的mi RNA30e-5p下游的靶基因为TP53INP1,荧光素酶报告基因实验证实,mi RNA30e-5p可直接与TP53INP1结合。mi RNA30e-5p上调和TP53INP1下调的HCCLM3细胞和Hep G2细胞的伤口愈合能力、迁移能力、侵袭能力以及成管能力强于mi RNA30e-5p上调和TP53INP1对照的HCCLM3细胞和Hep G2细胞。相反,mi RNA30e-5p下调和TP53INP1上调的HCCLM3细胞和Hep G2细胞的伤口愈合能力、迁移能力、侵袭能力以及成管能力比mi RNA30e-5p下调和TP53INP1对照的HCCLM3细胞和Hep G2细胞弱。在Western Blot实验中,观察到mi RNA30e-5p上调和TP53INP1下调的HCCLM3细胞和Hep G2细胞中VE-Cadherin、Vimentin、Snail、MMP2、MMP9的表达比mi RNA30e-5p上调和TP53INP1对照的HCCLM3细胞和Hep G2细胞强而E-Cadherin的表达结果相反。同理,mi RNA30e-5p下调和TP53INP1上调的HCCLM3细胞和Hep G2细胞中出现相反的结果。7.肝细胞肝癌组织中TP53INP1的表达低于邻近正常组织中的表达。TP53INP1的表达与MMP2、MMP9、VE-Cadherin、Vimentin、Snail的表达以及VM的存在呈负相关关系,与E-Cadherin的表达呈正相关关系。TP53INP1高表达的患者平均生存时间长于低表达的患者。TP53INP1的表达和VM的存在与患者的年龄、TNM分期、肿瘤大小、组织学分级无显著相关性,与肿瘤的转移有关(P<0.05)。lnc RNA n339260的表达与TP53INP1的表达呈负相关关系,同时mi RNA30e-5p的表达与TP53INP1的表达呈正相关关系。8.在lnc RNA n339260上调的细胞系中TP53INP1蛋白的表达减少,在lnc RNA n339260下调的细胞系中TP53INP1蛋白的表达增多。在mi RNA30e-5p上调的细胞系中TP53INP1蛋白的表达增多,在mi RNA30e-5p下调的细胞系中TP53INP1蛋白的表达减少。9.选择高侵袭性的HCCLM3细胞和低侵袭性的Hep G2细胞,建立TP53INP1的上调和下调的稳转细胞系。实验结果显示上调TP53INP1的HCCLM3细胞和Hep G2细胞伤口愈合能力、迁移能力、侵袭能力、增殖能力以及成管能力明显弱于对照组(P<0.05)。同时,下调TP53INP1的HCCLM3细胞和Hep G2细胞伤口愈合能力、迁移能力、侵袭能力、增殖能力以及成管能力较对照组明显增强(P<0.05)。在上调TP53INP1的HCCLM3细胞和Hep G2细胞的中MMP2、MMP9、VE-Cadherin、Vimentin、Snail的表达较对照组明显减少而E-Cadherin的表达增强(P<0.05)。在下调TP53INP1的HCCLM3细胞和Hep G2细胞的中MMP2、MMP9、VE-Cadherin、Vimentin、Snail的表达较对照组明显增多而E-Cadherin的表达明显减弱(P<0.05)。结论:1.在HCC组织中lnc RNA n339260与mi RNA30e-5p的表达水平呈负相关。lnc RNA n339260的高表达与mi RNA30e-5p的低表达和病人的不良预后相关。2.lnc RNA n339260和mi RNA30e-5p与EMT的表型相关,并且lnc RNA n339260能够促进EMT和VM的发生,mi RNA30e-5p能够抑制EMT和VM的发生。3.在体外实验中,lnc RNA n339260能够促进HCC细胞迁移、侵袭、增殖和管道形成能力;mi RNA30e-5p能够抑制HCC细胞迁移、侵袭、增殖和管道形成能力。4.在体外实验中,mi RNA30e-5p作为lnc RNA n339260的下游因子发挥作用,lnc RNA n339260能够减少mi RNA30e-5p的表达,从而起到促进EMT和VM发生的作用。5.TP53INP1是mi RNA30e-5p的靶基因,TP53INP1的上调能够部分增强mi RNA30e-5p介导的EMT和VM的抑制作用以及对肿瘤细胞生物学功能的抑制作用。6.在体外实验中,TP53INP1能够抑制HCC细胞迁移、侵袭、增殖和管道形成能力。7.mi RNA30e-5p通过靶向上调TP53INP1的表达,从而抑制Snail信号通路,从而抑制EMT和VM的功能。