碱性神经酰胺酶和中性鞘磷脂酶是调节生物体内鞘脂质代谢的关键酶类。鞘磷脂酶能水解神经鞘磷脂生成神经酰胺和磷酸胆碱,神经酰胺酶水解神经酰胺生成游离脂肪酸和神经鞘氨醇,这些鞘脂质在生物体内具有非常重要的生理作用。前期研究发现:碱性神经酰胺酶通过调控神经酰胺水平在果蝇的发育、生殖和存活中发挥重要的生理作用。在此基础上,我们提出神经酰胺酶和鞘磷脂酶能够调控二化螟体内神经酰胺水平,在二化螟的发育和存活过程中发挥重要作用的设想。本研究以重要农业害虫二化螟为研究对象,对二化螟的碱性神经酰胺酶和中性鞘磷脂酶的生化特征进行了研究,并初步探索了它们在二化螟体内的生理功能。本研究的最主要结果如下:1.由二化螟转录组测序数据获得其碱性神经酰胺酶saCER和中性鞘磷脂酶snSMase的基因片段序列,运用RT-PCR的方法克隆得到这两个基因的编码区cDNA序列。saCER开放阅读框(ORF)大小为807bp,可编码269个氨基酸;snSMase开放阅读框大小为1250bp,编码409个氨基酸。序列比对发现saCER蛋白序列与果蝇碱性神经酰胺酶(DaCER)具有56%的序列一致性,与人类、小鼠及酵母的碱性神经酰胺酶蛋白序列也有较高的同源性。snSMase蛋白序列与家蚕、蝴蝶、蚂蚁、赤拟谷盗等的中性鞘磷脂酶的蛋白序列分别具有70%、67%、42%和40%的同源性。此外,saCER和snSMase在sf9细胞中成功表达,Western blot检测这两个基因的表达产物分子量分别为38kD和44kD。2.对saCER的生化特征的研究,得到以下结果:pSORTII等程序对saCER蛋白结构、跨膜区域以及亚细胞定位的分析结果显示,saCER存在7个潜在的跨膜区域,说明saCER可能是多跨膜区域神经酰胺酶超家族中的一员;saCER主要定位于质膜和内质网上。在sf9细胞中大量表达的saCER蛋白,在37℃C下,以D-e-C24:1 ceramide为底物,能够明显地表现出神经酰胺酶的活性,说明saCER编码的蛋白具有神经酰胺酶的活性。saCER蛋白产物在pH 5.0到pH 10.0的范围内均具有神经酰胺酶的活性,但在pH9.0时活性最高,由此可说明saCER所编码的蛋白确实是碱性神经酰胺酶。3.对snSMase的生化特征的研究,得到以下结果:pSORTII等程序对snSMase蛋白结构、跨膜区域、亚细胞定位的分析结果显示,snSMase只存在1个潜在的跨膜区域,主要定位在内质网、高尔基体和线粒体上。我们推测snSMase也是一个跨膜蛋白。在sf9细胞中大量表达的snSMase蛋白,在37℃下,以C6-NBD-sphingomyelin为底物时,snSMase表现出来的鞘磷脂酶的活性是对照的10倍左右;在不同的pH条件下对snSMase的酶活力进行分析发现,它能够适应的pH范围很狭窄,仅在pH7.0左右表现出了较高的活性,说明snSMase确实是一种中性鞘磷脂酶。4.利用实时荧光定量PCR技术对saCER和snSMase生理功能的研究,得到以下结果:saCER和snSMase基因在二化螟不同发育阶段及不同部位都有表达。在所有的发育阶段中,saCER和snSMase均在蛹期的表达量最高,且随着二化螟从幼虫发育到成虫的发育进展,5aCER和snSMase mRNA的表达水平也不断升高,说明saCER和snSMase在二化螟的完全变态发育过程中发挥着重要的作用。在二化螟的不同的组织器官中,saCER在胸部和足部有最高的表达量,而snSMase在胸部和卵巢中的表达量显著高于其它组织器官,说明saCER可能参与二化螟蜕皮激素水平的调控并且在肌肉系统中发挥重要的生理作用,而snSMase则可能主要在二化螟蜕皮激素水平的调控及生殖过程中发挥生理作用。综上所述,本研究克隆得到的saCER和snSMase基因在昆虫细胞中表达后分别具有碱性神经酰胺酶和中性鞘磷脂酶的活性并可能在二化螟的鞘脂质代谢、发育及生殖过程中发挥重要的作用,具体的调节机制还有待进一步研究。