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目的:肝卵圆细胞是一类具有双向分化潜能的肝干细胞,在一定条件下可以分化为肝细胞和胆管上皮细胞。比肝细胞具有更小的免疫原形,有利于移植后的存活和增殖,从而更好的达到恢复器官功能,治愈疾病的目的。肝卵圆细胞作为一种干细胞,能够表达多种标志物,其中c-kit和CK-19是重要的标志物,用于对肝卵圆细胞进行定位和形念观察。本实验主要研究促进大鼠肝卵圆细胞增生的方法、肝卵圆细胞肝内增生的特点和分布规律;观察分析肝卵圆细胞的两种常见标志物c-kit,CK-19表达的相关性,寻找更加确切的肝卵圆细胞定位方法;探讨更好的肝卵圆细胞增殖模型,为体外分离肝卵圆细胞和细胞移植奠定基础。材料和方法:选用山东大学实验动物中心提供的120～150克的雄性Wister大鼠,设立三个实验组。A组:按每日每公斤体重15微克2-AAF连续灌胃,两周后处死,取肝。B组:行肝部分切除术(1/3),两周后处死,取肝。C组:利用2-AAF(美国Sigma公司提供)按每R每公斤体重15微克的剂量对大鼠灌胃,3天后在无菌条件下行肝1/3切除术,当天不喂药,术后继续灌药,第14天处死大鼠,取肝。所取肝组织固定、包埋制成石蜡包块,HE染色法观察各组大鼠肝组织内肝卵圆细胞增殖改变,免疫组化法检测卵圆细胞表达c-kit和CK-19的改变及其不同分组间的相关性。结果一肝卵圆细胞形态和分布规律:(一)形念特点:(1)细胞小,是成熟肝细胞的1/4～1/3,(2)细胞核呈圆形或卵圆形;(3)细胞质少,核/浆比例大。核浆比例大、呈卵圆形是其形态特征。见图5。(二)分布规律:增生的肝卵圆细胞主要分佃于汇管区小胆管周围,少量增生时呈点状分布,进而成团存在、簇状分布、外周布满成熟肝细胞;当大量增生后,可向肝小叶内延伸,呈片状分布,见图1-5。二实验各组间增生情况比较(HE染色):三组大鼠盯组织中均有卵圆细胞增生,位于汇管区周围,细胞较小,大小是成熟肝细胞的1/4～1/3,细胞核呈圆形或卵圆形,细胞质少,核浆比例大,具有肝卵圆细胞(hepatic oval cell,OC)的典型结构特征。A组大鼠肝组织中卵圆细胞占的细胞构成比率为10.98%;B组为11.72%;C组实验大鼠肝组织内可见有大量卵圆细胞增生,主要位于汇管区,细胞构成比率为21.13%。三者构成比行卡方检验,卡方值=9.8276,P=0.0073,差别具有统计学意义,表明三组细胞构成比具有显著性差异。A组与B组比较,卡方值=0.0573,P=0.8109,差别无统计学意义,二者无显著性差异;A组与C组比较卡方值=7.1633,P=0.0074,差别具有统计学意义,二者具有显著性差异;B组与C组比较卡方值=6.2596,P=0.0124,差别具有统计学意义,二者具有显著性差异。综上可见A组与B组细胞构成比无显著性差异,C组与A、B两组细胞构成比具有显著性差异,表明C组卵圆细胞增生最显著。二免疫组化染色c-kit和CK-19的表达改变:1.CK-19的表达:A组:(—)7,(+)13,(++)1,(+++)0,阳性率66.67%;B组:(—)8,(+)13,(++)2,(+++)0,阳性率65.22%:C组:(—)6,(+)14,(++)2,(+++)0,阳性表达率72.73%。总阳性率68.18%。三组数据行卡方检验分析:卡方值=0.3249,P=0.8501,差别无统计学意义;A组与B组比较卡方值=0.0103,P=0.9193,差别无统计学意义;A组C比较,卡方值=0.1871,P=0.6653,差别无统计学意义;B组与C组比较卡方值=0.2959,P=0.5865,差别无统计学意义。综上可见三组大鼠卵圆细胞CK-19的阳性表达率差异无显著性。2.c-kit的表达:A组:(—)6,(+)14,(++)1,(+++)0,阳性表达率71.43%;B组:(—)6,(+)16,(++)1,(+++)0,阳性表达率73.91%;C组:(—)4,(+)16,(++)2,(+++)0,阳性表达率81.82%,总阳性率74.24%。三组比较行卡方分析:卡方值=0.6969,P=0.7058,差别无统计学意义;A组与B组比较卡方值=0.0342,P=0.8534,差别无统计学意义:A组与C组比较卡方值=0.6498,P=0.4202,差别无统计学意义;B组与C组比较卡方值=0.4066,P=0.5237,差别无统计学意义。综上可见,三组大鼠卵圆细胞c-kit的阳性表达率差异无显著性。3.三组大鼠肝组织卵圆细胞CK-19和c-kit表达率比较CK-19总阳性率68.18%,c-kit总阳性率74.24%,二者行卡方检验分析,卡方值=0.5913。P=0.4419,差别无统计学意义,表明二者在卵圆细胞中的表达差异无显著性。4.CK-19与c-kit表达相关性:A组CK-19与c-kit表达相关性:列联系数r=0.8944,m=0.9048,P=0.0001,有统计学意义,二者表达具有相关性。B组CK-19与c-kit表达相关性列联系数r=0.8135,m=0.8261,P=0.0003,有统计学意义,二者表达具有相关性。C组CK—19与c-kit表达相关性列联系数r=0.7698,m=0.8182,P=0.0021,有统计学意义,二者表达具有相关性。5.三组大鼠总的c-kit和CK-19的表达相关性运用Pearson卡方检验分析:列联系数r=0.8281,m=0.8485,P=0.0000相关性具有统计学意义。表明二者在卵圆细胞中的表达具有明显相关性。结论1.单纯2-AAF灌胃、单纯肝部切除术、联合应用均可以促进肝卵圆细胞的增生,增生的肝卵圆细胞主要位于汇管区周围,大量增生时由汇管区向肝小叶内延伸,簇状到片状分布。2.2-AAF灌胃联合肝部分切除术效果最好,是较佳的肝卵圆细胞增殖模型。3.CK-19和c-kit是肝卵圆细胞表达的两种重要标志物,大鼠肝组织中c-kit表达阳性率74.24%,CK-19表达的阳性率为68.18%,二者表达具有相关性,有助于肝卵圆细胞的准确判断和定位。