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背景与目的组织因子途径抑制物-2（tissue factor pathway inhibitor-2,TFPI-2）是一种新近发现的具有Kunitz型结构的丝氨酸蛋白酶抑制物,它在人体内主要由构成血管的内皮细胞、平滑肌细胞以及成纤维细胞等合成,并分泌至细胞外基质（extracellular matrix,ECM）。TFPI-2在体外可强烈抑制纤溶酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶等多种蛋白水解酶活性,并能抑制由纤溶酶催化的基质金属蛋白酶原proMMP-1和proMMP-3的活化,但以往的研究证实其对基质金属蛋白酶（MatrixMetalloproteinases,MMPs）如MMP-1的活性并无直接抑制作用。研究还发现某些哺乳动物膀胱上皮可分泌TFPI-2,但其意义尚不清楚。业已证实,ECM被降解是肿瘤细胞浸润转移过程中的关键一步,而肿瘤细胞分泌的纤溶酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶等多种丝氨酸蛋白酶则在ECM降解中起重要作用。有研究表明,转TFPI-2基因纤维母细胞瘤细胞在SCID小鼠体内的生长速度明显滞后于未转染的瘤细胞,并且肺内转移率下降。有意义的是,通过实时荧光定量RT-PCR检测发现,转TFPI-2基因肿瘤组织血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）mRNA表达水平低于未转染者3-6倍。已知VEGF作为血管新生的正调控因子,特异性作用于血管内皮细胞的有丝分裂,刺激血管内皮细胞增殖和迁移,促进新生血管生长。上述结果说明TFPI-2在体内抑制肿瘤浸润生长和远处转移的作用,可能与其抑制VEGF的表达进而导致肿瘤血管新生减少有关。此后有研究者发现,转染TFPI-2的神经胶质瘤在体内的微血管形成受到抑制,在体外则毛细血管样结构生成减少,进一步提示TFPI-2可能参与肿瘤血管新生的调控。最近,在TFPI-2和VEGF相互关系方面又有新的研究进展,实时定量PCR和蛋白印迹分析显示,VEGF上调血管内皮细胞TFPI-2 mRNA和TFPI-2蛋白的表达,而且该调控作用呈现时间和剂量依赖性。反之,TFPI-2蛋白以剂量依赖方式抑制VEGF刺激内皮细胞增殖的作用以及VEGF诱导的内皮细胞迁移。此结果揭示TFPI-2可能以负反馈机制参与VEGF的调控。综上所述,TFPI-2抑制某些实体肿瘤VEGF的表达以及依赖于VEGF的血管内皮细胞增殖和迁移,具有潜在的抗血管新生作用。多发性骨髓瘤（Multiple myeloma,MM）作为造血系统常见恶性肿瘤之一,是严重威胁中老年人群健康的恶性疾病。近年来因为其发病率的上升但治疗手段有限而颇受关注。MM的发病机制复杂,其中血管新生是MM发生、发展非常重要的一个方面。血管新生与浆细胞标记指数呈正相关而与骨髓瘤患者的生存期呈负相关。由骨髓瘤细胞产生的促血管新生因子如VEGF和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）等与骨髓基质细胞（bone marrowstromal cells,BMSCs）、内皮细胞一起共同参与了多发性骨髓瘤血管新生。研究表明多发性骨髓瘤患者骨髓及外周血VEGF水平升高,而且血清VEGF与疾病分期和预后相关。因此,下调VEGF的表达水平进而抑制骨髓瘤血管新生,已成为治疗多发性骨髓瘤的有效措施之一。本研究旨在通过基因转染技术将TFPI-2基因导入MM细胞株,比较转染TFPI-2基因的细胞与转空质粒的细胞VEGF和VEGFmRNA的表达以及影响BMSCs分泌VEGF的差异,为MM的治疗提供新思路。研究方法1.细胞转染取对数生长期U266细胞,接种于用纤连蛋白包被的24孔培养板,每孔5×105个,培养24小时后用无血清RPMI-1640培养基洗涤2次转染前备用。用Lipofectamine 2000脂质体介导的基因转染技术将重组表达载体pcDNA3.0/TFPI-2和单纯表达载体pcDNA3.0转染到U266细胞。将前者设为实验组,后者为对照组。分别用含200 mg/L、400 mg/L、600 mg/L、800mg/L G418的全培养液抗性筛选,浓度为600 mg/LG418的全培养液筛选良好,阳性克隆继续在含400mg/L G418的培养液中传代培养,约经6周后,即可获得稳定筛选,用于下述体外试验。2.细胞培养①实验组和对照组的U266细胞以1×106细胞/ml/孔接种于48孔板中,在1%FBS的RPMI-1640中培养72小时后,收集上清,1500rpm离心5分钟,上清保存于-20℃冰箱,ELISA法检测VEGF浓度,细胞保存于-80℃冰箱中,供RT-PCR实验用。②BMSCs消化后,以1×105细胞/ml/孔接种于48孔板,以含10%FBS的DMEM培养液培养24h后弃去上清液,以无血清RPMI-1640洗涤2次,再分别加入实验组和对照组的U266细胞（2×105细胞/ml/孔）,以无血清RPMI-1640培养48h后收集上清液,1500rpm离心5min,保存于-20℃冰箱,ELISA法检测VEGF浓度。3.TFPI-2 mRNA的测定采用Taqman Probe RQ-PCR技术检测转染TFPI-2基因和对照组细胞内TFPI-2 mRNA含量,通过独立样本t检验比较两组TFPI-2 mRNA表达是否具有统计学差异,检验水准α=0.05。4.VEGF的测定采用人VEGF的ELISA检测试剂盒,按试剂盒说明书进行操作,测定单独培养转染TFPI-2基因和转染空质粒细胞和BMSCs与转染TFPI-2基因和转染空质粒细胞共同培养的培养液中VEGF含量。先采用两因素水平的析因分析,确定转TFPI-2基因与共同和BMSCs培养无交互效应,然后再通过独立样本t检验比较两组VEGF含量是否具有统计学差异,检验水准α=0.05。5.VEGF mRNA的测定采用SYBR GreenⅠRQ-PCR技术检测转染TFPI-2基因和对照组细胞内VEGF mRNA含量,利用公式Folds=2（-△△Ct）进行相对定量,计算转染TFPI-2基因组与转染空质粒组mRNA表达的倍比关系,并通过独立样本t检验比较两组VEGF mRNA表达是否具有统计学差异,检验水准α=0.05。实验结果转染TFPI-2基因组与对照组细胞内的TFPI-2 mRNA含量有显著差异,前者显著低于后者（20.4440±15.72140 vs 0.7549±0.49670,P<0.05）,这说明TFPI-2基因成功转染入U266细胞。单独培养的转染TFPI-2基因和对照组上清液中VEGF蛋白含量无显著差异（86.75±7.76ng/ml vs 91.53±11.58ng/ml,P>0.05）,BMSCs与转染TFPI-2基因和对照组细胞共同培养的上清液中VEGF含量有显著差异,前者显著低于后者（7.66±0.25ng/ml vs 8.86±0.44ng/ml,P<0.05）。转染TFPI-2基因和对照组细胞的细胞内VEGFmRNA含量无显著差异(2（-△△Ct）分别为0.6130±0.07159,0.8270±0.08380,P>0.05)。结论转TFPI-2基因细胞组分泌的VEGF与对照组的未见明显差异,表明TFPI-2基因可能不直接抑制骨髓瘤细胞分泌VEGF。BMSCs和转基因骨髓瘤细胞共同培养后,转TFPI-2组细胞上清液中VEGF含量明显低于对照组。实验结果提示TFPI-2基因可能间接抑制BMSCs产生和分泌VEGF,进而能减少MM血管新生,抑制MM的发生与发展,但其机制有待于进一步研究。