肺癌(Lung cancer)是世界上发病率和致死率最高的肿瘤。在我国肺癌每年发病人数超过100万,并以每年递增26.9%的速度迅速增长,但是患者的5年生存率不到15%,因此肺癌已经取代肝癌成为恶性肿瘤首位死亡原因,是威胁人类健康的首要杀手。根据病理特征的不同,肺癌被分为两大类,非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC),前者主要包括肺腺癌(adenocarcinoma)、肺鳞癌(squamous carcinoma)和大细胞肺癌(large cell lung cancer),约占肺癌发病率的80%左右。小细胞肺癌的发病率虽然只占肺癌总数的20-25%左右,但却是肺癌中恶性程度最高、分化最低的一类肿瘤。肺癌的致病因素有多种,吸烟、环境污染是其主要的诱发因素。近年的流行病学调查结果表明,随着环境污染的加重,小细胞肺癌的发病率逐年上升,其发病年龄在30-70岁之间,男性多于女性,并呈现出年轻化的趋势。小细胞肺癌起源于支气管粘膜或腺上皮内的Kulchitsky细胞(嗜银细胞),细胞体积较小,胞浆少,核较大,且具有一定的神经内分泌功能,可分泌5-羟色胺和促肾上腺皮质激素等物质。小细胞肺癌的恶性程度高,主要有由于：(1)倍增时间短、增殖迅速；(2)发病早期就易发生全身广泛的远端转移；(3)对放化疗敏感,然而易复发并产生耐药。小细胞肺癌的这些特性,导致患者的中位生存率在7-12个月,两年生存率为5%左右,五年生成率小于2%,因此探讨小细胞肺癌的发病机制是突破小细胞肺癌治疗瓶颈的关键。本论文侧重于小细胞肺癌侵袭转移的机制研究,鉴于小细胞肺癌增殖快、易转移的特性,我们重点分析控制细胞由G1期进入S期的关键蛋白E2F1在细胞侵袭转移中的作用。E2F1作为经典的转录因子,通过结合在下游靶基因启动子的特异结合位点上调靶基因的表达,在细胞周期调控、细胞增殖中发挥关键的调控作用。在肿瘤发生过程中,E2F1过表达能够促进纤维细胞的恶性转化,诱导皮肤和肝癌的发生。新近研究发现,E2F1通过调控thrombospondin1、血小板源性生长因子受体(Platelet-derived growth factor receptor, PDGFR)、血管内皮生长因子受体(Vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)等蛋白的表达,参与肿瘤浸润转移和血管的生成过程；通过调控ABCG2, bcl2和miR-205的表达参与肿瘤细胞的耐药。然而,也有研究表明,E2F1过表达能够促进乳腺癌、卵巢癌、神经胶质细胞瘤、头颈鳞癌以及黑色素肿瘤的凋亡,抑制细胞的生长和增殖。E2F1的敲除鼠(E2F1-/-)能够发展成一个全身广泛的肿瘤,包括肺腺癌、生殖系统肿瘤和淋巴系统肿瘤。因此,E2F1与肿瘤的发生、恶性转化等存在复杂的关系。E2F1作为转录因子,与下游靶基因的结合能力具有重要作用。E2F家族有8个成员,都具有相似的DNA结合结构域,表明E2F1调控的靶基因也有可能被其它E2Fs家族成员所调控。研究表明,E2F1的转录调控作用有特殊之处,可通过蛋白—蛋白相互作用与其它的转录因子结合,共同调控目的基因的表达,如E2F1和转录因子Spl结合能够募集到胸苷激酶、c-myc以及双氢尿嘧啶脱氢酶的启动子上。然而,Alina, et al,2001的文献指出E2F1调控的靶基因只与E2F1的DNA结合结构域有关,不依赖于其它的结构域。综上所述,E2F1的调控作用机制、在肿瘤发生发展中的作用等都亟待进行深入细致的研究。临床资料研究显示,在95%左右的小细胞肺癌组织样本中E2F1的表达水平升高,但高表达的E2F1在小细胞肺癌中的作用尚不清楚。本论文首先利用ChIP-to-seq技术分析转录因子E2F1在小细胞肺癌细胞中调控的靶基因序列,发现E2F1调控的靶基因中存在与细胞侵袭转移密切相关的基因；其次,确定了E2F1通过调控金属蛋白酶((Matrix metalloproteinases, MMPs)基因的表达促进小细胞肺癌的浸润迁移；三,分析了E2F1参与小细胞肺癌上皮细胞间质化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)发生的机制。第一部分：E2F1在小细胞肺癌中调控靶基因的鉴定本研究首先鉴定了E2F1在中国汉族人群肺癌患者中的表达模式,并利用ChIP-to-seq的方法分析了E2F1在小细胞肺癌中调控的靶基因；同时我们从已报道的E2F1、E2F4和E2F6在不同肿瘤细胞中的ChIP-to-seq数据库,分析E2F1在不同肿瘤细胞以及E2Fs家族不同成员(主要是E2F1、E2F4和E2F6)在同一肿瘤细胞中调控靶基因的相似性,力图阐明E2Fs家族成员调控不同靶基因表达的可能机制。本部分主要研究结果如下：一、E2F1在小细胞肺癌中高表达1、E2F1在不同病理类型肺癌组织中的表达：E2F1在肺癌组织中的表达,在不同的种族人群中,其结果不一致,特别是在非小细胞肺癌的表达差异较大。我们首先对140例中国汉族人群不同病理类型肺癌组织中的E2F1表达进行分析。结果显示：与毗邻的正常肺组织相比,E2F1在95.56%(86/90)的小细胞肺癌组织,50%(5/10)的大细胞肺癌组织和10%(2/20)的肺腺癌组织中表达,而在肺鳞癌组织中没有检测到E2F1的表达(0/20)。在小细胞肺癌组织中,E2F1表达阴性、弱阳性、中度阳性和强阳性的组织标本数分别为4、11、23和52例。在肺腺癌中,仅有2例弱阳性染色被发现。在大细胞肺癌中,2例弱阳性和3例强阳性染色被发现。以上结果表明E2F1在小细胞肺癌中高表达。2、E2F1在不同肺癌细胞中的表达：利用蛋白印迹实验检测E2F1在不同类型肺癌细胞株中的表达。结果表明,E2F1在小细胞肺癌(H1688和H446)、正常支气管上皮细胞(HBE,阳性对照)中表达较高,而在肺腺癌细胞(A549、H1299和H292)、肺鳞癌细胞(SK-MES-1)和正常成纤维上皮细胞(HFL-1)中的表达较低。3、E2F1可以作为一个独立的、负相关因素来评价小细胞肺癌病人的预后。由于E2F1在小细胞肺癌中表达较高,我们首先应用Spearman相关分析统计E2F1低、中、高表达和临床各病理因素之间的相关性。结果表明,E2F1和小细胞肺癌的临床病理分期之间具有显著的相关性(r=0.552,P<0.01)。在局限期(limited disease,LD)的患者中,E2F1的表达较低(13/30)；而在广泛期的患者(extensive disease, ED), E2F1表达较高(58/60)。卡方检验结果表明在E2F1低、中、高表达的病人中,临床分期具有显著的差异性。单因素生存分析结果显示E2F1的表达和临床分期可以作为评价小细胞肺癌患者预后的指标,而其他指标包括性别(P=0.768),年龄(p=0.818),吸烟(P=0.827),肿瘤大小(P=0.411)与病人的预后之间无统计学意义。多因素生存分析结果表明,E2F1可以作为一个独立的负相关指标来评价小细胞肺癌患者的预后(HR=0.461,95%CI:0.230-0.925,P=0.029)。以上结果表明高表达的E2F1可以作为一个独立的、负相关因素来评价小细胞肺癌病人的预后。二、E2F1在小细胞肺癌中调控靶基因分析1、E2F1调控的靶基因在基因组中的分布：应用MACS1.4.0软件将Chip-to-seq样本的结合位点峰值与人的refseq hg19数据库中所有编码基因和非编码基因的promoter区进行比对,我们发现E2F1在小细胞肺癌细胞株H1688细胞中,可靶向调控4700个编码基因和626个lncRNA。单一结合位点读长在基因组中的分布如下：intergenic(57.89%), down20k (12.87%), exon (2.3%), inron (38.42%), up20k (13.98%).2、E2F1调控靶基因的GO分析：为了进一步明确E2F1在小细胞肺癌细胞株H1688细胞中调控靶基因的功能,我们应用GO聚类分析对靶基因的功能进行了分类。在GO数据库中,靶基因编码的蛋白被分成了三个组：cellular components, molecular function以及biological processes。结果表明,E2F1调控的基因分别有3593,、3799以及2362个基因分别归属于以上三类。在这些基因中绝大多数基因与细胞周期调控、DNA代谢、RNA加工修饰以及细胞分裂、染色体组装等生物功能有关。3、E2F1调控靶基因的Motif分析：应用MEME4.7.0DNA结合Motif序列分析软件,从基因组DNA中寻找并鉴定出了3个E2F1结合的Motif序列,分别是TCAGGCCCCGCCCCC, AAACTACAATTCCCAGCAGGCCTTGGGCC以及TTTTTTTTTTTTTTTCTATTC。其中Motif1的p值为8.9e-082,覆盖宽度为15bp,高度为7.5cm,总共有198个位点；Motif2的p值为1.0e-025,覆盖宽度为29bp,高度为7.5cm,总共有17个位点；Motif3的p值为8.0e-016,覆盖宽度为21bp,高度为7.5cm,总共有36个位点。三、E2Fs家族成员调控靶基因的序列相似性分析1、E2F1在H1688和Helas3细胞中调控的靶基因序列相似性分析：根据文献中E2F1在helas3细胞中的Chip-to-seq原始数据,应用曙光5000A服务器千核平台,鉴定了E2F1在helas3细胞中调控的靶基因。结果表明,在helas3细胞中E2F1共调控的靶基因数目是5292个；其中在H1688和helas3细胞中都调控的基因数目是1864个；E2F1在H1688中单独调控的靶基因有2836个,而在helas3细胞中单独调控的靶基因有3428个。根据GO聚类分析结果,分别得到E2F1在H1688和helas3细胞中共同调节的编码基因以及单独调节编码基因的GO分析图谱以及functional enrichment图,以阐明不同靶基因之间功能上的相互联系。为探讨E2F1在不同细胞中调控靶基因差异的原因,随后我们分析了E2F1在H1688和helas3细胞中结合DNA Motif的差异,发现在helas3细胞中E2F1也有3个DNA结合Motif,其中Motif1与H1688细胞基本一致,但是Motif2和Motif3与H1688细胞中的Motif有较大区别。以上结果表明,E2F1在不同的肿瘤细胞中,虽然有相同的DNA结合结构域,但是由于其结合DNA Motif的差异,导致他们调控的靶基因也有较大的区别。2、E2F1、E2F4和E2F6在helas3细胞中调控靶基因序列相似性分析：虽然E2Fs家族成员有相似的DNA结合结构域,但它们调控的靶基因却有较大区别,为此,我们分析了E2F1、E2F4(?)E2F6在helas3细胞中调控靶基因序列相似性。结果表明,在helas3细胞中,E2F1、E2F4(?)E2F6分别调控的靶基因数目是5232、3566以及4513个。E2F1和E2F4、E2F1和E2F6以及E2F4和E2F6共同调控的靶基因数目分别是是2323、2178和1778个,其中三者共同调控的靶基因数目是1275个。GO聚类图和functional enrichment图以及分析它们共同和独有的Motif序列,发现结合DNA Motif序列的差异是导致E2Fs不同家族成员调控靶基因序列差异的主要原因。第二部分：E2F1通过调控MMPs基因表达促进小细胞肺癌侵袭转移ChIP-to-seq的结果显示,基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)是E2F1在小细胞肺癌中调控的靶基因。由于E2F1在小细胞肺癌中表达较高,且E2F1与肿瘤的血管生成和浸润转移有关,因此,我们探讨了E2F1是否通过调控MMPs基因的表达、促进小细胞肺癌浸润转移。研究结果如下：一、E2F1促进小细胞肺癌浸润转移1、下调E2F1基因表达可显著抑制小细胞肺癌浸润转移能力：高表达E2F1的小细胞肺癌H1688和H446细胞具有较强的迁移能力,我们首先通过siRNA降低E2F1的表达、分析细胞移动能力的变化。Transwell结果表明,下调E2F1基因表达后,H1688和H446细胞,穿过基质胶覆盖小室的能力显著降低。与Transwell实验结果相一致,伤口愈合实验结果表明,下调E2F1的表达,H1688和H446细胞向划痕迁移的能力显著低于正常对照和干扰RNA阴性对照组。2、过表达E2F1基因后,A549细胞浸润转移能力显著增加：为了验证E2F1对细胞浸润转移能力的影响,我们在低表达E2F1的A549细胞(相对于小细胞肺癌细胞株H1688和H446)中转染E2F1的表达载体,Transwell和划痕实验结果表明,过表达E2F1的A549细胞,其侵袭、转移以及伤口愈合能力显著增强。二、E2F1通过调控MMPs基因的表达,参与小细胞肺癌的浸润转移1、MMPs在小细胞肺癌组织中的表达分析：我们应用免疫组化的方法检测90例小细胞肺癌组织标本中MMP-2、7、9和16的表达。结果表明MMP-7、9和16在小细胞肺癌组织中的表达分别为73.33%(66/90),86.67%(78/90)和100%(90/90),然而MMP2在小细胞肺癌组织标本中的表达没有被检测到。通过对MMPs家族成员在小细胞肺癌组织中的表达分析,我们推测MMP-9和16在小细胞肺癌浸润转移过程中可能发挥作用。2、E2F1在转录水平调节MMPs的基因表达：由于MMPs在小细胞肺癌中表达增强,我们利用siRNA、定量PCR和蛋白印迹技术分析E2F1的促细胞迁移能力是否通过上调MMPs的表达而实现的。在小细胞肺癌H1688和H446细胞中下调E2F1基因表达后,real time PCR和western blotting结果显示,MMP-3,7,14和15虽然降低,但无明显的统计学意义；但是MMP-9和16的表达显著降低,与正常对照和阴性对照相比,统计学差异显著,表明E2F1可在转录水平调控MMP-9和16的表达。3、E2F1通过DNA结合结构域直接调控MMP-16的表达：因为MMP16在所有的小细胞肺癌组织样品中(90/90)都表达,因此我们选择了MMP16作为研究对象,研究E2F1调控其表达的详细机制。首先,免疫组化染色结果显示在E2F1染色阳性的小细胞肺癌组织标本中,MMP16的表达也同样较高。MatInspector软件分析显示,MMP16基因启动子序列中含有E2F1转录因子的结合位点。双荧光素酶报告基因结果显示,E2F1能够显著增加野生型MMP16启动子的活性。E2F1结合位点突变体的分析结果显示MMP16启动子中的E2F1结合Motif2(ggtgGGCGggaagaaag)可能是E2F1调控MMP16基因表达的主要调控位点。4、E2F1通过调控转录因子Sp1和p65的表达,间接调控MMP-9的表达(1)E2F1可上调小细胞肺癌细胞中MMP9的表达：报告基因分析结果显示,E2F1表达升高,MMP9启动子的活性显著增加,但E2F1的结合位点(tcagggaggGA AAaaga)突变后,E2F1仍然上调MMP9启动子活性,表明E2F1可能不通过结合此位点发挥作用。利用siRNA下调E2F1表达后,MMP9的表达显著降低。上述结果提示E2F1可能通过间接途径调控MMP9基因的表达。(2)Sp1和p65能够调控MMP-9的表达：MatInspector软件分析显示,在MMP9启动子上有4个Spl和2个NF-KappaB的结合位点,我们随后验证是否这些转录因子的结合位点介导E2F1对MMP9的表达。报告基因分析结果显示,过表达Sp1能够显著增强MMP9启动子活性,分别将4个Sp1结合位点突变后进行分析,确定Sp1可通过结合Sp1结合motif3(gacctaGGAGggggtg)4(aggaggGGTGgggtcag)促进MMP9的表达。同样,增加转录因子p65的表达能够促进MMP9基因启动子的表达活性,突变分析结果表明,NF-KappaB的结合motif1(cagtggaaTTCCcca)和2(ctgggtcTTGCctg)都可介导p65对MMP9的表达调控。为了进一步验证Sp1和p65对MMP9的表达调控作用,我们通过siRNA下调Sp1和p65基因表达后,均可在转录和蛋白水平降低MMP9的表达。(3)E2F1可调控Sp1和p65的表达：ChIP-to-seq的结果显示,Sp1和p65同样是E2F1的靶基因。上述结果提示,E2F1可能通过Sp1和p65介导对MMP9的表达调控。我们首先通过免疫组化的方法,检测了E2F1、MMP9、Sp1和p65在90例小细胞肺癌组织标本中的表达,发现它们的阳性表达率分别为：95.56%、86.67%,93.33%和98.89%,而且在MMP9、Spl和p65表达阳性的标本中,E2F1的表达也呈现强阳性,表明E2F1和Sp1、p65以及MMP9的表达呈正相关。和临床样本的结果一致,下调小细胞肺癌的E2F1水平后,细胞中Sp1和p65的表达也显著降低。通过比较野生型和E2F1结合位点突变体的Sp1和p65报告基因的表达活性,确定E2F1通过Sp1启动子中E2F1结合motif3(actgcGCGCcgaatgcc)、p65启动子中E2F1结合motif1(gatcGGCGggagggggc)和2(cagaGGCGgaaatgcgc)发挥调控作用。因此,E2F1分别通过不同的调控机制促进MMP9和MMP16的表达,从而发挥促进细胞侵袭转移的作用。第三部分：E2F1通过调控Sip1的表达参与小细胞肺癌EMT的发生对上述结果的仔细分析发现,下调E2F1的表达可降低MMPs的水平并抑制细胞的迁移,但并不能完全消除细胞的侵袭和转移,提示存在其它机制参与此过程。ChIP-to-seq的结果显示,小细胞肺癌细胞中Smad相互作用蛋白1(Smad-interacting protein1, Sip1)是E2F1直接调控的靶基因,而Sip1是参与上皮细胞间质化(Epithelial-mesenchymal transitions, EMT)过程的重要转录因子,提示我们E2F1有可能通过调控Sip1的表达,参与EMT的发生过程。本部分主要研究结果如下：一、E2F1对细胞骨架及其紧密连接蛋白表达的影响1、下调E2F1的表达改变细胞表型：我们利用慢病毒作为载体,构建了稳定敲除E2F1的小细胞肺癌细胞株H446-E2F1si。与阴性对照细胞相比,H446-E2F1si细胞形态有显著变化,细胞由从瘦长的纤维状转变呈椭圆状,同时细胞的迁移能力显著降低,呈现EMT变化趋势。在H446-E2F1si细胞中,稳定敲除E2F1基因表达后,E2F3和E2F8的表达上调,有统计学意义。在A549中,补充E2F1基因表达后,E2Fs家族其他成员的表达无明显的变化。2、E2F1对细胞骨架及紧密连接蛋白表达的影响：稳定敲除E2F1基因表达后,细胞形态呈现EMT表型变化,随后我们分析其骨架蛋白、细胞连接蛋白的变化。结果表明,在H446-E2F1si细胞中骨架蛋白alpha-tublin和beta-actin的表达显著降低,紧密连接蛋白claudin-7,-17,-25以及occludin的表达无明显改变。但是claudin-11和ZO-1的表达显著升高,其中ZO-1的表达升高最为显著。在A549-E2F1细胞中,只有ZO-1的表达降低,细胞骨架蛋白和其他紧密连接蛋白的表达无明显统计学意义。二、E2F1对EMT发生相关蛋白表达的影响1、E2F1对E-cadherin, beta-catenin, Vimentin和N-cadherin表达的影响：Real-time PCR结果表明,在H446-E2F1si细胞中,beta-catenin的表达显著升高,间质细胞特征的Vimentin和N-cadherin的表达显著降低,E-cadherin的表达略有下调但无统计学意义。而在A549细胞中高表达E2F1后,E-cadherin和beta-catenin的表达显著降低,而Vimentin和N-cadherin的表达显著升高,提示E2F1可促进间质细胞特征性基因的表达。蛋白印迹和免疫荧光结果显示,在H446-E2F1si细胞中Vimentin和N-cadherin的表达显著降低,但并无E-cadherin蛋白的表达：在A549-E2F1细胞中,相关蛋白的表达和mRNA的表达趋势相一致。另外,我们检测了小细胞肺癌细胞株H1688中E-cadherin的表达变化,下调E2F1表达可在转录和蛋白水平显著诱导E-cadherin的表达。上述结果表明,E2F1通过影响EMT发生相关蛋白表达,促进EMT的发生。2、E2F1对EMT发生相关转录因子sip1, snail和twist表达的影响：鉴于E2F1的转录因子作用,我们进一步分析E2F1对EMT发生相关转录因子sip1, snail和1twist表达的影响。结果显示,在H446细胞中,稳定敲除E2F1基因表达后,sip1的mRNA、蛋白的表达均显著降低,而sanil和twist的表达无明显的变化。在A549细胞中,过表达E2F1基因后,snail的表达显著升高,然而sip1的表达也显著降低。上述结果表明在小细胞肺癌中E2F1有可能通过调控sip1的表达参与EMT的发生,然而在肺腺癌细胞中过表达E2F1能够上调snail和下调sip1的表达,表明在肺腺癌中E2F1促进EMT发生的机制比较复杂,有待于进一步研究。三、E2F1调控Sipl表达的分子机制上面的结果提示在小细胞肺癌中sip1可能介导E2F1促进EMT的发生过程。我们应用免疫组化的方法首先分析sip1在小细胞肺癌组织中的表达情况。结果表明,sip1几乎在所有的小细胞肺癌组织标本中均呈样性表达,而且sip1表达阳性的小细胞肺癌标本,E2F1的表达也呈现强阳性,提示两者有一定的调控关系。报告基因结果显示,sip1启动子活性在H446-E2F1si细胞中显著降低,进一步证实在小细胞肺癌中,E2F1能够调控sip1的表达,进而参与EMT的发生。结论、创新点及不足之处一、结论1、转录因子E2F1在小细胞肺癌中表达较高,可以作为一个独立的负相关因素评价小细胞肺癌病人的预后。2、E2F1在不同肿瘤细胞中调控的靶基因有明显的差异；虽然E2Fs家族成员有相似的DNA结合结构域,但是它们调控的靶基因有明显的区别；其根本原因是由于E2Fs家族不同成员它们结合DNA的Motif不同所致。3、MMP-9和16在小细胞肺癌中表达较高。E2F1通过直接调控MMP16或间接调控MMP9的表达,参与小细胞肺癌浸润转移的过程。4、E2F1通过调控sip1的表达,进而调节小细胞肺癌EMT的发生。二、主要创新点和不足之处1、首次报道了E2F1在中国汉族人群中的表达模式,MMP7、MMP16、p65以及sip1在小细胞肺癌标本中的表达。2、首次阐明E2F1在小细胞肺癌中调控的靶基因序列,并且较全面的比较了E2Fs家族成员在不同肿瘤细胞中调控靶基因的区别。3、首次阐明E2F1通过调控MMPs、sip1的表达、促进EMT的发生、促进小细胞肺癌浸润转移的作用机制。4、本研究不足之处主要表现在所应用的临床病理标本均是石蜡切片,缺乏新鲜的小细胞肺癌标本；其次E2F1在肺腺癌中促进EMT发生的机制尚需进一步研究。