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灰飞虱是一种重要的农业害虫,目前防治灰飞虱的方法主要是化学防治,然而长期、大量的使用化学药剂使灰飞虱产生抗药性。水通道蛋白是细胞膜内嵌蛋白超家族的主要成员,具有传输水分子以及小分子化合物进出细胞膜的功能。在原生动物与蠕虫类寄生虫的研究中发现,水通道蛋白还与抗寄生虫药物的吸收有着直接或间接的关系。为了探究灰飞虱水通道蛋白及其与抗药性的关系,我们开展了如下研究。根据转录组数据,采用PCR和RACE技术对灰飞虱体内的水通道蛋白基因AQP进行了克隆,此后进行了序列同源性分析,并利用进化树对获得的基因进行了亲缘关系的分析验证,检测了多态性位点和可能的抗药性相关突变,利用实时荧光定量PCR技术分析这些基因在灰飞虱抗、感品系间的表达量差异,利用体外表达技术分析了表达产物的物质转运活性。主要结果如下:一、灰飞虱水通道蛋白基因的克隆及序列分析根据灰飞虱转录组数据分析得到的AQP基因片段,设计特异性引物进行克隆验证,并通过RACE技术扩增和end-to-end验证,获得了 6个基因全长序列,分别命名为LsAQP1、LsAQP2、LsAQP3、LsAQP4、LsAQP5、LsAQP6。它们分别编码编码 272氨基酸、248氨基酸、346氨基酸、247氨基酸、274氨基酸、273氨基酸。BLAST分析发现所克隆的基因与其它昆虫的AQP基因氨基酸序列相似性最高,而且都具有6个跨膜区、NPA三联体位点和几乎全部的Ar/R(aromatic/arginine)残基等功能保守区,表明克隆得到的是灰飞虱体内的同源AQP基因。将灰飞虱AQP基因氨基酸序列和之前已经验证过的其他22种昆虫的78个AQP基因一起进行进化分析,同样显示昆虫AQPs至少存在四个亚家族,即果蝇内嵌蛋白(Drosophila integral protein,DRIPs),萤火虫内嵌蛋白(Pyrocoelia rufa integral protein,PRIPs),黑腹果蝇大脑蛋白(D.melanogaster big brain protein,BIBs)和第四个未能分类的亚家族。在克隆到的灰飞虱AQP基因中,LsAQP1属于PRIPs亚家族,LsAQP2属于DRIPs亚家族,LsAQP3属于BIBs亚家族,LsAQP4、LsAQP5、LsAQP6属于未能分类的亚家族。二、灰飞虱水通道蛋白基因的表达分析利用定量PCR技术检测灰飞虱体内6个AQP基因在四种抗、感品系(吡虫啉抗性品系、毒死蜱抗性品系、乙虫腈抗性品系、敏感品系)里的表达量差异。根据结果分析,LsAQP1、LsAQP2、LsAQP3、LsAQP4、LsAQP5在不同抗性品系中的表达量均无显著上升。但LsAQP6在抗吡虫啉、毒死蜱和乙虫腈的三种抗性品系中均高表达,且与敏感品系表达量差异显著。在3个抗性品系的连续3代测定中,第一代LsAQP6基因相对表达倍数分别为5.64倍、2.75倍和3.19倍,第二代相对表达倍数为3.93倍、4.29倍和1.95倍,第三代相对表达倍数为1.03倍、3.50倍和8.99倍。由此可以说明,LsAQP6在灰飞虱抗性形成中可能发挥一定作用。三、灰飞虱呲虫啉抗性品系中水通道蛋白基因的突变位点分析在克隆得到6条灰飞虱水通道蛋白基因全长的基础上,设计专一性引物从吡虫啉抗、感品系中克隆不同AQP基因的全长为代表,克隆并比较了抗、感品系各10头灰飞虱的不同水通道蛋白基因的全长编码序列,以寻找抗药性相关突变位点。结果对克隆得到的抗、感试虫序列进行比对分析发现,LsAQP1、LsAQP2、LsAQP3、LsAQP4、LsAQP5、LsAQ6基因各自的不同序列存在不少多态性位点,其中LsAQP4的最多,达38个,而LsAQP5的最少,仅有18个。但来自抗、感品系个体的序列之间没有固定的差异,NPA保守位点和Ar/R选择性位点也没有发现突变,说明这些基因均没有抗药性相关的突变位点。四、LsAQP1和LsAPQ6在非洲爪蟾卵母细胞中的表达和功能分析为了分析在抗性品系中高表达基因LsAQP6在灰飞虱体内的功能,本研究将该基因注射入非洲爪蟾卵母细胞中表达,并以未注射、注射水和注射在抗感品系中无差异表达基因的代表LsAQP1做对照,进行水、甘油和农药的转运实验。鉴于多数杀虫剂的分子量大,水溶性差,本研究仅选用了灭多威和杀虫双作为代表。结果发现LsAQP6对水具有较高的转运能力,对灭多威也具有显著的转运能力,但对甘油和杀虫双则没有表现出显著的转运能力。而在抗感品系没有表达差异的LsAQP1,对测定的四种物质均没有表现出明显的转运能力。由此认为LsAQP6在灰飞虱体内对水和某些小分子农药具有转运作用。综上所述,本研究基于转录组数据克隆获得了 6个灰飞虱全长水通道蛋白基因,并发现LsAQP6不仅在不同抗药性品系中过表达,且对水和某些小分子农药具有显著的转运功能,其过量表达可能在灰飞虱的抗药性形成中发挥作用。该结果为进一步研究灰飞虱水通道蛋白奠定了基础,为研究水通道蛋白在农业害虫抗药性中的作用提供了依据,对于灰飞虱的抗性检测、治理以及新药开发也具有重要意义。