目的对于手术患者来说,术前恐惧的发生是一种普遍的现象。恐惧情绪作为一种复杂的应激源,在使机体产生生理变化的同时还带来对情绪和心理上的伤害。如何有效的抑制术前恐惧的发生,使患者能够身心健康的渡过围手术期是临床上亟待解决的问题。通过查阅文献,得知恐惧的形成和记忆的储存均与系统内多巴胺递质的活化密切相关。而课题组前期的临床试验结果表明,氯胺酮复合咪达唑仑可确切的减少小儿术前恐惧的发生,并且通过动物实验证明其部分作用原理包括:影响海马及小脑内NMDA受体和GABA受体的表达来实现抑制恐惧情绪的发生与记忆的储存。那么应用氯胺酮复合咪达唑仑是否也能通过影响多巴胺系统来发挥其抑制恐惧的作用。本实验以巴普洛夫经典条件反射学说为理论基础,建立具有恐惧条件反射的大鼠模型,通过喂食氯胺酮和咪达唑仑的方法观察动物的行为学变化,以木僵持续时间百分比(freezing%)作为评价大鼠恐惧程度的指标,并对鼠脑进行组织学切片,利用免疫组织化学技术对多巴胺及其1受体表达情况进行分析。材料和方法1、动物雄性、健康、清洁级Wistar大鼠112只,均由中国医科大学动物部提供。2、试剂与器材试剂:氯胺酮及咪达唑仑药品由中国医科大学盛京医院麻醉科提供;多巴胺1受体兔抗大鼠多克隆抗体,配套SABC检测试剂盒及DAB显色液均购自武汉博士德生物技术有限公司;多巴胺小鼠抗大鼠多克隆抗体购自Santa公司,配套SABC检测试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。器材:自制电击笼;XJ-2356型生理刺激发生仪,DIK-245型音频发生器,显微镜3、方法行为学训练:将大鼠称量体重后平均分为4组,即盐水组(N组)、氯胺酮组(K组)、咪达唑仑组(M组)和氯胺酮复合咪达唑仑组(K+M组)。根据巴甫洛夫经典条件反射学说,将声音刺激作为条件刺激,将足底电刺激作为非条件刺激。将大鼠置于电击笼内,在给与30s的声音刺激后给与5s的足底电刺激。每天训练重复4次,共训练5天,每天训练前30m给与相应药品。第6天观察行为学指标,以评价恐惧程度。免疫组化检测:训练最后一天用药后,取0min、10min、30min、60min、120min、180min、360min作为时间点,处死后取脑组织。应用SABC法,按试剂盒说明书所示步骤进行免疫组化检测。4、结果判定以木僵持续时间百分比(freezing%)作为行为学指标,木僵行为即为除呼吸和心跳行为之外无任何体动。其统计方法为以10s为一观察时间段,如有体动记为“0”,如为木僵则记为“1”,最后以10个时间段内出现木僵行为的百分比作为观察指标。免疫组织化学:以胞浆及胞膜中出现棕黄色颗粒为阳性染色,随机选取5个高倍视野(400×)测量光密度,取其平均值作为评价其染色强弱的指标。5、统计分析方法采用SPSS13.0统计软件,配对t检验进行相关分析,采用双侧检验,P＜0.05为具有统计学意义。实验结果1、木僵持续时间百分比(freezing%)N组的平均freezing%值为74%±16%,K组为49%±12%,M组为23%±10%,K+M组为15%±10%。对照组的freezing%显著高于实验组,P值均小于0.01。2、DA1R在前脑皮质、中脑及海马组织内的表达情况(每张切片高倍镜下取5个视野计算平均光密度值)。对照组、K组、M组及K+M组在前脑皮质、中脑、海马中的光密度值分别为0.5565±0.0215、0.5121±0.0278、0.5362±0.0263;0.3877±0.0248、0.4245±0.0247、0.4195±0.0216;0.3959±0.0235、0.4288±0.0300、0.4232±0.0252;0.3981±0.0260、0.3896±0.0203、0.4031±0.0254,各实验组与对照组作T检验,P均＜0.01。3、DA在前脑皮质、中脑及海马的表达(每张切片高倍镜下选取5个视野计算平均光密度值)。对照组、K组、M组及K+M组在前脑皮质、中脑、海马中的光密度值分别为0.6272±0.0241、0.5905±0.0259、0.5755±0.0235;0.4993±0.0229、0.5040±0.0235、0.5195±0.0224;0.5000±0.0256、0.4868±0.0231、0.5047±0.0238;0.4162±0.0264、0.4754±0.0223、0.4573±0.0219,各实验组与对照组作T检验,P均＜0.01。4、各时间点的DA1R和DA表达情况从各时间点的递质及受体表达情况可知用药后30分钟左右时的表达显著低于其他时间点,P＜0.05。结论1、氯胺酮及咪达唑仑可显著降低大鼠的恐惧反应,可消除恐惧记忆。2、氯胺酮及咪达唑仑可显著降低大鼠脑内,包括前脑皮质、中脑和海马内DA1R和DA的表达。3、经消化道给药后30min左右作用最强,360min左右恢复到用药前水平。