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目的报告基因常用于测定启动子对基因表达的影响及其与反式作用因子的相互作用，通过测定报告基因表达的水平，来间接评价在调控序列指导下对基因表达的影响。目前最常用的是双萤光素酶报告分析系统，其中一种用于待测启动子活性分析，另一种作为内参照校正。课题组应用这种方法长期开展基因上游调控序列的研究。β-NF属于黄酮类物质，是很多抗氧化酶的典型诱导物，在研究药物对二相解毒酶等作用的时候，常被用作阳性对照。本实验在应用双萤光素酶报告分析方法研究β-NF对人GCLC基因的影响时，发现与文献报道结果相反，这种问题困扰了我们很长时间，因此我们设计了不同实验来观察β-NF对萤光素酶报告基因的活性影响。方法1、双萤光素酶报告分析方法筛选合适的影响人GCLC基因的外界刺激：利用人GCLC基因调控序列驱动的GCLC-PGL3-enhancer-Luciferase报道载体（PL45）转染人细胞，添加不同刺激因子（不同浓度）进行刺激，双荧光素酶报告基因检测系统分析其对GCLC基因表达的影响；2、western blot检测β-NF刺激后内源性GCLC蛋白表达的变化；3、双荧光素酶报告基因检测系统分析β-NF对Luciferase基因表达的影响：分析β-NF刺激转染了表达Luciferase的真核表达载体pRC/CMV2-luc+后对Luciferase基因表达的影响；PL45转染细胞，裂解细胞后用β-NF刺激，分析β-NF对Luciferase基因表达的影响。结果1、在不同的刺激中，Bap对GCLC表达有上调作用，与文献报道一致，但多次实验结果显示β-NF对GCLC起强烈抑制作用，β-NF的这种作用与文献报道相反；在A549细胞中，通过添加两种激酶抑制剂，发现β-NF对GCLC的抑制作用与MAPK和GSK-3β两种途径无关。2、在多种组织来源的细胞中报告基因检测系统结果显示β-NF对GCLC的表达均有强烈抑制作用；Western Blot结果显示，β-NF上调内源性GCLC的表达；转染非β NF反应性报道载体结果显示，β-NF同样有强抑制作用；收集并裂解细胞后用β-NF刺激，结果显示β-NF依然表现出强烈的抑制作用，并且与表达无关。结论Luciferase报告基因系统常用于研究基因的转录调控。我们在研究β-萘黄酮对GCLC基因表达的影响时发现，β-萘黄酮直接抑制了报告基因的活性，因此在应用Luciferase报告基因系统研究黄酮类药物对二相解毒酶基因的表达的影响时需考虑药物对报告基因的可能影响，应综合应用多种方法进行多方面的验证才能得出可靠的结论。目的肺及支气管组织易受到来源于体内外各种氧化因素的作用而造成肺及支气管损害，形成肺部的炎症性疾病或肺部肿瘤。GSH是肺组织内抗氧化机制中的最重要物质之一。多种环节可在不同水平调节细胞内外GSH浓度，抵抗肺及支气管组织的损伤或保护肺组织免受氧化损害，其中转录水平调控是GSH合成的限速酶——γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ--GCS）基因最重要的调控环节，因此有必要对γ-GCS特别是催化亚单位（GCLC）合成的转录调控进行研究。γ-GCS基因转录调控研究发现多个有功能的顺式调控元件位于GCLC基因的调控区，其中有抗氧化反应元件（ARE）、活化蛋白-1（AP-1）结合元件、核因子-κB（NF-κB）结合元件等。本课题组前期研究在人GCLC基因上游调控区-2744—+81bp区段发现了多个正性及负性调控序列：GCLC基因转录起始位点上游-810—-769bp区间存在负性调控区；GCLC基因转录起始位点上游-864—-838bp、-769—-538bp、-421—-341bp区间则存在正性调控区。其中位于-810—-769bp区间含有AP-2和NF-κB元件，但AP-2的作用机制尚未得到进一步研究。本实验采用定点突变法对AP-2和NF-κB元件进行重新研究。另外，尝试应用EMSA和DNA-Protein Pull-Down法探索-850—-782bp区域的有功能的调控元件和可能的转录因子。方法1、-850~-782bp区间转录调控的实验研究：定点突变-810—-769bp区间的AP-2和NF-κB元件并考察其对GCLC基因表达的影响；考察不同长度缺失体报道载体对GCLC基因表达的影响。2、EMSA实验寻找-850~-782bp区间有功能的调控元件；3、DNA-Protein Pull-Down法探索-850—-782bp区域可能的转录因子。结果1、成功构建出定点突变NF-κB和AP-2元件的报道载体，转染结果发现NF-κB和AP-2元件为负调控元件；2、不同长度的缺失体片段转染结果显示-838—-810bp为一负调控区，-810—-782bp为一正调控区。3、EMSA以及DNA-Protein Pull-Down结果表明，GCLC基因上游调控区域-838—-815bp和-810—-782bp均有核蛋白结合，但仍未找到可能的转录因子。结论-810—-769bp的NF-κB和AP-2元件为负调控元件，-850—-782bp区域仍需进一步的探索。