本研究根据GENBANK中查出的禽流感病毒H₅亚型，禽流感病毒H₉亚型的HA片段基因组序列，利用DNASIS软件分别对AIV的H₅、H₉亚型HA基因区域进行同源性比较，设计筛选出两对联合PCR反应的特异性引物，其中一对是H₉亚型通用引物，扩增出HA片段695bP，另一对引物为H₅亚型的通用引物，扩增出的HA区域部分目的片段约为448bP。建立各自的单项RT-PCR，并用电泳鉴定PCR扩增产物，结果证明为各自的特异性核酸片段。在单项RT-PCR基础上，优化引物浓度，Mgcl₂浓度，Tag酶、dNTP浓度，循环次数等反应条件后，建立了H₅、H₉亚型的多重RT-PCR，同时扩增出禽流感病毒H₅、H₉两种亚型不同大小的特异性片段，并进行了反应条件的优化。建立的多重RT-PCR扩增其它相关病毒未见阳性结果。两个亚型的单项RT-PCR可以检测鸡胚尿囊液培养物10^-3稀释物，多重PCR可以检测到10^-2稀释物。初步应用四份子鸡胚尿囊液培养物，六份临床病料的检测，并与电镜负染、琼扩及病毒分离的结果进行比较，此诊断方法与病毒分离的结果一致，比琼扩和电镜负染检出率高，可用于临床和试验室诊断。