基于纤维素滤纸条的DNA快速提取法的建立及其在植物样品分子鉴定中的应用

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脱氧核苷酸(Deoxyribonucleic acid,DNA)是绝大多数生物的遗传物质。基于DNA分离、纯化和扩增的基因检测技术作为分子鉴定的重要手段,被广泛地应用于生物种质鉴定、预防动植物疾病、食品安全监控、转基因生物检测等领域。十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethylammonium bromide,CTAB)方法是经典的DNA提取方法,但是由于其复杂且耗时的操作流程不能满足DNA快速检测的需求。纤维素滤纸法由于能够在短时间内从生物样品中快速获取可扩增的DNA,近年来逐渐受到人们的重视。有关纤维素滤纸的应用多报道于对转基因动物或病菌快速检测的技术中,而在植物的DNA快速提取方面的相关研究还比较少。因此,进一步优化利用纤维素滤纸提取植物样品DNA的方法将有助于推动生物学实验室基础研究、植物种质资源鉴定以及转基因植物、食品和药材鉴定等分子鉴定技术的发展。本研究对已报道的基于纤维素滤纸条的DNA提取法进行了两个方面的优化:首先,针对原方法中滤纸条会变形而带走过多的反应液而导致核酸扩增效率降低的缺点,在吸附DNA的纤维素滤纸条背部增加了聚氯乙烯树脂(Polyvinyl chloride resin,PVC)塑料板支撑。这种优化的方法被命名为EASY DNA(EZD),意指简单快速地提取DNA(EASY DNA extraction),相应的经优化的滤纸条被命名为EZ-D试纸条。与原纤维素滤纸条相比,EZ-D试纸条所获得的DNA的PCR扩增效率显著提高。其次,本研究对DNA提取缓冲液进行了优化,使之更加适合于多种植物样品的DNA的快速提取。与传统的CTAB方法相比,EZ-D方法展现了很多的优点:不仅能将DNA提取时间从三个小时缩短至30秒,还能将DNA提取成本从0.9元降低到0.2元。同时,EZ-D方法使DNA提取技术摆脱了仪器的束缚并更加适用于现场分子检测。为了评估EZ-D方法在提取植物DNA的应用效果,本研究对EZ-D从植物样品中获取的DNA的能力以及所提取的DNA的可扩增能力进行了评价。结果显示,EZ-D方法不仅能够成功地从多种植物以及植物组织中提取DNA,而且至少可以从植物组织提取液中提取0.1 ng的DNA用于PCR扩增反应。以EZ-D方法所得到的植物DNA为模板,可用于扩增长度长达3000 bp的DNA片段,或可以用于扩增GC含量高达80%的DNA片段。将EZ-D方法与环介导的等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)相结合,可以实现不依赖PCR仪等检测设备,在现场对转基因植物的外源基因进行快速鉴定和中药超微粉的快速分子检测。综上所述,本研究提出了优化的基于纤维素滤纸的DNA提取方法EZ-D。EZ-D在应用中展现了很大的优势,它能够广泛地应用于仪器缺乏却需要快速获得鉴定结果的实验室。EZ-D方法不仅能够丰富利用纤维素滤纸纯化植物DNA的研究,而且能促进纤维素滤纸快速纯化植物DNA方法的应用和推广。
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