研究背景：糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是由于高血糖导致内分泌代谢紊乱的全身性疾病,它能够造成包括骨骼、神经、肾脏等多器官多系统损伤。糖尿病患者胰岛素相对或绝对缺乏,矿物质组织代谢紊乱。无论是临床还是实验研究均显示,糖尿病能够改变骨的生物力学性能、影响骨折的愈合。许多研究表明,糖尿病骨折愈合时间大约是非糖尿病患者的两倍。每年虽然数以百万计的骨折发生,大多数治愈令人满意,但仍有5%至10%会继续延迟愈合或不愈合,甚至导致假关节形成或骨骼畸形,造成肢体功能障碍,严重影响患者的生活。因此如何治疗糖尿病骨折日益受到人们的重视。人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs)和骨髓间充质干细胞(human bone marrow MSCs, hBMSCs)一样是一类具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞。但提取骨髓间充质干细胞时需要有创操作,而且提取数量较少。另外,随着年龄的增大,hBMSCs自我更新和增殖能力降低。最近,人脐带间充质干细胞越来越受到人们的关注,人脐带间充质干细胞可以向骨、软骨、韧带、肌腱、肌肉及脂肪等方向分化。其来源丰富,成本较低,而且无需有创操作。另外,hUCMSCs免疫排斥反应较低,无肿瘤致畸性。因此其在组织工程、干细胞移植以及基因治疗等领域具有广阔的应用前景,成为干细胞研究的热点,也为我们治疗糖尿病骨折愈合提供了新的思路。糖尿病影响骨折愈合的原因较复杂,而细胞因子在骨折愈合过程中的改变是其中重要的因素之一。其中TGF-β1和 BMP-2在骨折愈合过程中具有非常重要的作用。研究表明：TGF-β1和BMP-2是骨重建和骨修复过程中重要的细胞因子。在骨折愈合过程中,TGF-β1促进间充质干细胞和成骨细胞的增值,BMP-2是膜内成骨和软骨内化骨中非常重要的因子,其在骨折愈合过程中的研究较多,但是在糖尿病骨折愈合过程中的TGF-β1l和BMP-2的变化研究相对较少。应用人脐带间充质干细胞治疗糖尿病骨折愈合研究更少。我们应用大鼠制作糖尿病骨折动物模型,研究糖尿病骨折愈合过程中TGF-β1和BMP-2的变化。并应用人脐带间充质干细胞,诱导分化为成骨细胞,然后移植到骨折部位,观察糖尿病骨折愈合过程中TGF-p1和BMP-2的变化。为其临床治疗糖尿病骨折提供理论依据。研究目的：1.人脐带间充质干细胞的培养及成骨分化。2.糖尿病对骨折愈合的影响及TGF-pl和BMP-2在骨折愈合过程中的变化。3.人脐带间充质干细胞注射入骨折部位后,对糖尿病骨折愈合的影响。研究方法：1人脐带间充质干细胞的分离、鉴定及分化。1.1细胞培养人脐带间充质干细胞的分离、培养。获取健康、足月、剖腹产胎儿脐带,剥离脐带wharton’sjelly胶,充分剪碎,酶消化法获得脐带间充质干细胞,体外传代、纯化、扩增,倒置显微镜下观察细胞形态。1.2人脐带间充质干细胞的表面分子标志检测收集培养的第3代hUC-MSCs,加入CD14-PE.CD73.PE、CD105-PE.CD34-FITC..CD44-FITC.CD45-FITC.CD90-FITC.MHCⅡ-FITC单克隆抗体,1gGl-PE. 1gG1-FITC作为同型对照,24小时内应用流式细胞仪对细胞表面的CD分子进行鉴定。1.3人脐带间充质干细胞的成骨分化及成脂分化1.3.1收集第3代hUC-MSCs,以成骨诱导培养基培养,诱导7天后,行碱性磷酸酶染色；诱导分化21天后,进行茜素红染色,检测钙化基质沉淀。1.3.2收集第3代hUC-MSCs,以脂肪诱导培养基培养,诱导分化培养14天后,进行油红0染色。2糖尿病动物骨折模型的制作。2.1糖尿病骨折动物模型的制作及分组。雄性Wister大鼠75只随机分为三组：糖尿病组(n=25)、HUCMSCs组(n=25)、正常对照组(n=25)。糖尿病组及HUCMSCs组大鼠腹腔注射四氧嘧啶(160mg/kg)建立糖尿病动物模型,当血糖浓度血糖大于16.7mmol/l,则为糖尿病大鼠模型诱导成功。中途死亡和造模失败的大鼠再行造模补充,以保证每次每组用于检测的大鼠数量为5只。糖尿病模型制作成功后,在无菌条件下将三组动物均用手术方法于左胫骨上中1/3交界处用线据锯断胫骨人为造成左胫骨骨折。然后复位外固定。HUCMSCs组大鼠在骨折处用注射器穿刺至骨折端注射成骨诱导7天的第三代干细胞1x107个/Kg,正常对照组和糖尿病组注射等量的生理盐水做为对照。2.2骨密度检测对各组实验动物在术后1周、2周、3周、4周、5周,每组随机分别选取5只大鼠,然后使用DEXA骨密度仪扫描测定骨折处新生骨痂BMD,计算机记录数据。检测时骨密度仪设置为实验小动物模式,以新生骨痂为中心由近至远扫描1厘米范围,每组标本测量三次,每次测量前都重置标本,取平均值。2.3组织学及免疫组化学检查手术后第1、2、3、4、5周,每组分别随机抽取动物各5只大鼠,麻醉状态下以骨折端为中心,切取上下各0.5cm长标本,一半取出后立即放入液氮中储存(用于荧光定量RT-PCR检测),一半立即置入10%福尔马林中固定24小时,10%ED’ A脱钙、包埋完毕后,石蜡切片机将骨组织切成5μm厚切片。常规进行病理切片的制作,免疫组化检测按说明书进行。Leica-QwinV3图像分析软件检测TGF-β1和BMP-2灰度值的变化。2.4荧光定量RT-PCR检测每组5只胫骨骨痂样本在液氮中取出后,进行荧光定量RT-PCR检测。qRT-PCR采用SYBR绿色PCR试剂盒,不加模板和反转录反应物的做为阴性对照。用GAPDH作为RT-PCR的内参,设定PCR程序。荧光定量PCR仪检测相关数据并进行分析。研究结果：1.采用酶消化法能有效分离纯化hUCMSCs。接种24时后,贴壁细胞形态多为长梭型、多边形或成纤维细胞样形态、大小均一,9天后成旋涡状生长。流式细胞仪分析,第3代细胞高表达CD44、CD73、CD90及CD105,低表达D14、CD34、CD45及MHCIⅠ。经成骨诱导分化后碱性磷酸酶染色呈强阳性,茜素红染色可见明显钙结节,油红O染色可见胞浆中红色的油滴。2.大鼠注射四氧嘧啶后,大部分在24-48 h后出现多饮、多食、多尿、血糖增高、呆滞、皮毛松散、体重下降等表现,血糖大于16.7mmol/l,糖尿病模型造模成功。3.骨密度结果显示：在术后第1周,三组大鼠骨痂局部骨密度测量值没有明显统计性差异(P>0.05)；但在术后第2,3,4,5周,我们发现糖尿病大鼠组骨痂局部骨密度值随着时间逐渐增加,但在相应时间点其密度值明显低于对照组,其差异具有统计学意义；hUC-MSCs组骨密度值在术后第2,3,4,5周高于糖尿病组,差异具备显著性(P<0.05),但是与对照组相比较,差异无统计学意义(P>0.05)。4.组织学及免疫组化显示：糖尿病鼠软骨细胞及成骨细胞成熟延迟,骨痂形成较慢。免疫组化显示：骨折后1-3周TGF-β1、 BMP-2在细胞内广泛表达,特别是在骨痂和骨膜内,而糖尿病组骨痂组织中表达明显低于正常组与hUC-MSCs治疗组。hUCMSCs组和糖尿病组无明显差别。5. BMP-2、TGF-β1实时荧光定量RT-PCR检查显示：正常组断端骨痴组织BMP-2在第2周达高峰,而糖尿病组在第3周达高峰；正常组断端骨痴组织TGF-β1在第3周达高峰,而糖尿病组在第4周达高峰；糖尿病组TGF-β1 BMP-2表达比正常对照组均推迟1周,BMP-2？TGF-β1在 hUC-MSCs组表达在第2、3周均较糖尿病组高,但和正常对照组相比差别不大。结论：1.在体外应用酶消化法能获得人脐带间充质干细胞,人脐带间充质干细胞具有多向分化能力,可分化为成骨细胞及脂肪细胞。2.糖尿病大鼠骨折后骨折愈合速度慢、愈合延迟。3.糖尿病降低骨折处骨痂骨密度,影响骨折部位骨痂形成。4.糖尿病明显降低TGVF-β1、BMP-2表达,进而影响大鼠骨折处骨痂形成,是引起骨折愈合差的原因之一。5.应用人脐带间充质干细胞治疗后,糖尿病大鼠骨痂处细胞因子BMP-2、TGF-β1表达增多,骨密度提高,这可能是干细胞治疗改善骨折愈合的分子机制之一,可为临床治疗糖尿病骨折提供理论支持。