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研究背景肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是一种恶性程度高、进展迅速、难治性的恶性肿瘤。病人常诊断于中晚期,而用于中晚期肝癌的治疗手段非常有限,传统的化疗、放疗等治疗效果均不太理想,故寻找肝癌新的治疗方法是目前迫切需要的。目前,免疫治疗是肿瘤治疗中比较热门的研究领域,也被认为是一种非常有远景的治疗策略。基于树突状细胞（Dendritic Cells,DCs）的免疫治疗一直备受关注,目前在许多人类恶性肿瘤中已进行广泛的临床研究,并显示了一定的疗效。研究者们针对DCs的刺激性抗原也进行了广泛的探索,并使用肿瘤细胞的裂解物作为基于DCs免疫治疗的广谱抗原,但是临床反应率有限。因此需要进一步寻找和发展具有临床实际应用价值的DCs疗法。恶性肿瘤细胞在快速生长的进程中常伴有内质网应激（Endoplasmic Reticulum stress,ERs）的发生。肿瘤的ERs有促进肿瘤生长和抑制抗肿瘤免疫应答的作用。然而,过度的ERs也可能会诱发肿瘤细胞发生凋亡而释放大量的免疫原性分子,激发抗肿瘤免疫应答。然而,在体内,由于肿瘤微环境中存在大量的免疫抑制性因子和细胞,肿瘤ERs的免疫原性凋亡引发的抗肿瘤免疫反应不足以逆转肿瘤微环境的免疫抑制状态。因此,提高肿瘤细胞的免疫原性和改善肿瘤抑制性微环境值得探索。外泌体（exosomes）生理作用的发现引起了肿瘤研究者们广泛的关注。外泌体由细胞分泌的一种膜性囊泡,代表一类新的非细胞性的抗原。肿瘤外泌体携带了大量亲代肿瘤细胞的抗原物质。有研究发现,肿瘤外泌体冲击DCs介导的抗肿瘤免疫效应强于肿瘤细胞裂解物。本研究发现,用肝癌细胞的外泌体冲击DCs能介导抗肿瘤免疫应答。重要的是,ERs肝癌细胞的外泌体冲击DCs介导的抗肿瘤免疫效应强于未ERs肝癌细胞外泌体,但是原因和机制尚不清楚。因此探索ERs肝癌细胞外泌体携带的抗原成分及其介导抗肿瘤免疫应答,对于基于DCs免疫治疗的新抗原的发现具有重要意义。目的观察ERs肝癌细胞外泌体对DCs影响及DCs体内外介导的抗肿瘤免疫效应;通过蛋白质谱技术寻找ERs与未ERs肝癌细胞外泌体中差异表达的蛋白,分析和探讨该蛋白在ERs肝癌细胞外泌体对DCs影响中的作用,为基于DCs免疫治疗的新抗原的发现提供理论基础。方法（1）使用衣霉素(（Tunicamycin,TM）诱导HepG2发生ERs,Western-blot检测ERs相关蛋白的表达。（2）从ERs和未ERs HepG2的培养上清中提取外泌体,电子透射显微镜下观察外泌体形态,Western-blot鉴定外泌体中CD63、TSG101等蛋白的表达。将ERs和未ERs HepG2外泌体标记为:“EXO-TM”和“EXO-CON”。（3）PKH67（膜荧光染料）标记外泌体,将PKH6-外泌体与DCs共孵育12小时,激光共聚焦显微镜下观察DCs对外泌体的摄取。（4）用ERs或未ERs HepG2外泌体冲击DCs,倒置显微镜下观察DCs细胞形态,流式细胞仪检测DCs的表面分子的表达,CBA试剂盒检测炎性细胞因子。未成熟DC标记为“iDC”;ERs或未ERs HepG2外泌体冲击的DCs标记为:“DCEXO-TM”和“DCEXO-CON”（5）用荧光染料CFSE预染的淋巴细胞与DCs共培养,细胞比例为5:1,流式细胞仪检测并分析细胞的增殖情况,CBA试剂盒检测淋巴细胞因子。（6）通过RTCA（实时细胞分析仪）DP系统连续监测淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。按效:靶（CD8+T细胞:肿瘤细胞）为25:1,计算杀伤效率。（7）用ERs与未ERs鼠肝癌细胞的外泌体处理鼠DC2.4,并检测DC2.4的表面分子的表达;将各处理组的DC2.4与鼠淋巴细胞共培养,检测淋巴细胞增殖效应、CD8+/CD4+T细胞的比率、淋巴细胞因子IFN-γ分泌以及T淋巴细胞介导的肿瘤杀伤效应。（8）将ERs和未ERs鼠肝癌细胞外泌体冲击鼠DC2.4,并接种于荷异位肝癌小鼠模型,系统性的观察其介导的抗肿瘤效应。（9）通过蛋白质谱技术比较ERs和未ERs HepG2外泌体中的蛋白差异,并用Western blot验证差异蛋白的表达。（10）通过特异性shRNA干扰技术构建稳定低表达HSP90的HepG2细胞系(命名为HepG2shHSP90),观察ERs的HepG2shHSP9的外泌体（标记为“EXO-TMshHSP90”）对DCs的影响及介导的抗肿瘤效应。结果（1）HepG2中的ERs相关蛋白的表达与TM作用的浓度和时间相关,当使用2.5μmol TM作用24小时,ERs相关蛋白的表达变化最显著。（2）在HepG2培养液提取物中,透射电镜观察到一组直径30-120nm的杯状圆形小囊泡。Western blot证实其富含CD63和TSG101,缺乏Calnexin蛋白,与文献报道的“外泌体”特征相符。（3）激光共聚焦显微镜观察到DCs的胞质内呈现数量不等的绿色圆点。提示外泌体可被DCs摄取。（4）倒置显微镜下观察到DCEXO-TM比DCEXO-CON和iDC的树突稍长;细胞表面分子（如HLA-DR、HLA-ABC、CD80、CD86、CD83）表达更高;促炎性的细胞因子（如IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12和TNFα）分泌更多（p<0.05）。（5）DCEXO-TM对淋巴细胞增殖诱导效应强于iDC（p<0.05）,但与DCEXO-CON无明显差别（p>0.05）;DCEXO-TM增加CD8+/CD4+细胞比率（p<0.05）和细胞因子（如IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNFα和INF-γ）的分泌（p<0.05）。（6）DCEXO-TM和DCEXO-CON均可介导T细胞特异性和非特异性肿瘤杀伤效应,在24小时,DCEXO-TM的效应强于DCEXO-CON（p<0.05）。（7）使用ERs与未ERs鼠肝癌细胞的外泌体处理鼠DC2.4,也得到类似于人DCs的结果。结果发现,与iDC组和DCEXO-CON组相比,DCEXO-TM组细胞的表面分子MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、CD80、CD86、CD83上调较显著;诱导淋巴细胞增殖效应较明显（p<0.001）;CD8+/CD4+T细胞比率明显增加（p<0.05）;淋巴细胞因子IFN-γ分泌也明显增加（p<0.05）。观察DCs介导的T淋巴细胞对肿瘤的杀伤效应,在24小时和36小时,DCEXO-TM介导的T淋巴细胞对肿瘤杀伤效应均高于iDC和DCEXO-CON组（p<0.05）。（8）鼠的DCEXO-TM和DCEXO-CON接种荷异位肝癌小鼠,结果发现,与DCEXO-CON组和iDC组相比,DCEXO-TM组肿瘤生长速度最慢（p<0.01）,肿瘤体积最小（p<0.01）,肿瘤浸润性和脾脏中CD8+/CD4+T细胞比率明显增加（p<0.05）,小鼠血清中INF-γ水平升高（p<0.01）。（9）蛋白质谱技术鉴定发现,EXO-TM和EXO-CON差异表达蛋白160个,EXO-TM较EXO-CON高表达71个蛋白（>1.25倍）,通过GO分析发现较多的伴侣蛋白和免疫功能相关蛋白,其中HSP90高表达至2.548倍。（10）DCEXO-TMshHSP90（EXO-TMshHSP90冲击DCs）的表面分子较DCEXO-TM有一定程度的下调,其介导的T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤效应也有所减弱（p<0.05）。结论ERs肝癌细胞外泌体冲击DCs介导的抗肿瘤免疫效应强于未ERs肝癌细胞外泌体,且ERs的肝癌细胞外泌体冲击DCs能介导特异性和非特异性T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤效应;ERs肝癌细胞外泌体冲击DCs有助于改善了荷异位肝癌小鼠的肿瘤微环境。提示,ERs肝癌细胞的外泌体可能是基于DCs免疫治疗的潜在的、广谱的肿瘤抗原。