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猪流感是一种由猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)引起的猪的急性呼吸道疾病,其主要临床特征是发热、嗜睡、厌食症和鼻塞,给养猪业带来了巨大的经济损失。猪流感病毒主要包括H1N1,H1N2和H3N2三个亚型。猪一旦感染,会迅速发病,且常与其他呼吸道病原体混合感染。目前,猪流感血清学诊断方法主要包括血凝抑制试验和ELISA,虽然血凝抑制试验是猪流感血清学诊断的标准方法,但该方法结果的判定存在主观性,而且不适宜大规模样品的检测。传统ELISA方法主要是基于多克隆抗体和单克隆抗体而建立的,但单克隆抗体的制备费时费力,且生产成本高,多克隆抗体存在特异性低的问题。纳米抗体具有分子量小、稳定性好、高亲和力、高特异性和易于基因工程改造等优势,并且可通过不同的表达系统获得,是一种良好的诊断和治疗工具。本研究应用原核表达系统表达SIV高度保守的核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,NP),并通过噬菌体展示技术筛选NP蛋白特异性纳米抗体,纳米抗体与生物素受体肽融合表达和纯化后,通过生物素受体肽与生物素的结合标记生物素,用生物素化的纳米抗体作为阻断抗体,建立了一种特异的,敏感的和重复性好的检测猪血清中流感抗体的阻断ELISA方法,主要结果如下:1:SIV-NP蛋白的表达和纯化将pET-32a-NP重组质粒转化至Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,获得可溶性表达的NP蛋白,用Ni-NTA亲和层析柱纯化后,与弗氏佐剂混合用于双峰驼的免疫。2:SIV-NP蛋白特异性纳米抗体的筛选第5次免疫后一周,采集双峰驼外周血,分离淋巴细胞,提取总RNA反转录为cDNA,通过巢式PCR扩增VHH基因,将VHH基因克隆至噬菌体载体pCANTAB 5E,并通过噬菌体展示技术淘选NP蛋白特异性的纳米抗体,三轮淘选后得到6株纳米抗体,亲和力验证试验结果表明,Nb5具有较高的亲和力。3:纳米抗体的生物素化在Nb5氨基酸序列的C端连接生物素受体肽(biotin acceptor peptide,BAP),将基因序列克隆至pET-21b原核表达载体,并转化至E.coli BL21(DE3)IPTG诱导表达后得到以包涵体形式表达的Nb5-BAP融合蛋白,用Ni-NTA亲和层析柱纯化后进行透析,通过生物素标记试剂盒在体外将生物素标记在Nb5的C端受体肽上,标记完成后通过间接ELISA测得效价可达1:100000以上。4:阻断ELISA方法的建立与评价通过棋盘滴定ELISA确定最佳的抗原包被量为1μg/mL,1 mg/mL纳米抗体的最佳稀释比例为1:30000,血清的最佳稀释比例为1:10,同时用109份猪的阴性血清确定Cut-off值为29.8%,建立的阻断ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性,而且与商品化试剂盒和Western blot具有较高的一致性。综上所述,本研究筛选到了SIV-NP蛋白特异性纳米抗体,其中用纳米抗体生物素化的Nb5作为阻断抗体,建立了一种检测猪血清中流感抗体的阻断ELISA方法,可用于检测猪血清中流感病毒抗体水平和评价疫苗免疫效果。