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沙门氏菌属（Salmonella genus）是无芽孢的革兰氏阴性杆菌,细胞内寄生,在人和动物的肠道内寄生。禽致病性沙门氏菌病被世界动物卫生组织列为B类传染病。禽致病性沙门氏菌病具有传染性,对我国养禽业产生了严重的危害。近些年,随着养禽业规模发展之快速,禽致病性沙门氏菌病严重导致了养禽行业不可预测的经济损失,与此同时公共卫生问题也一定程度的受到了影响。目前,禽性沙门氏菌的研究较多集中于鸡源性沙门氏菌。本课题通过利用分离和鉴定细菌的方法对禽致病性沙门氏菌进行分离与鉴定,对禽致病性沙门氏菌分离株的5个主要毒力岛核心蛋白基因运用多重PCR方法进行检测并优化,建立简单、便利、快速、高效的多重PCR检测方法同时检测禽致病性沙门氏菌5个主要毒力岛核心蛋白基因。针对禽致病性沙门氏菌,本研究构建优化后的多重PCR检测方法可为该类疫病的病例进行精确、快速的诊断,并为治疗提供关键的技术支持,也可以提供真实可信的数据为流行病学调查提供真实可信的数据支撑。具体研究内容及结果如下:1、鸡致病性沙门氏菌的分离鉴定临床患沙门氏菌的病鸡一般急性病例可见脾脏、肝脏和肾脏充血、肿大,肝脏上可能有直径24 mm的白色病灶,有呼吸道症状的患禽,其肺脏有白色结节,心包增厚,心包内可能有渗出物,心肌或胰腺可能会出现似马立克氏病肿瘤的白色结节,偶尔可在盲肠或直肠壁上看到结节。病鸡剖解过程中采集具有沙门氏菌典型症状的组织样本和肠道粪便,通过分离鉴定得到致病性沙门氏菌。结果显示:通过SS琼脂选择培养基培养长出无色、透明、有黑色中心的小菌落。挑取典型菌落在氯化镁孔雀绿肉汤,沙门氏菌增菌液变浑浊的初步鉴定为疑似沙门氏菌。在三糖铁培养基培养斜面为红色、底层穿刺后为黑色,产生H2S。再进行生化试验鉴定,用鉴定沙门氏菌成套生化管的结果显示与沙门氏菌相识度为100%,判断出分离的菌属是沙门氏菌属。试验利用PCR技术扩增的分离菌16S rRNA基因,扩增出特异性的目的片段大小约1381 bp,与预期目的片段的大小一致。通过把Gen Bank数据库中的已知序列与测序结果做对比,该分离菌的16S rRNA序列与鼠伤寒沙门氏菌的同源性达99%,结果表明该分离菌为鼠伤寒沙门氏菌。动物回归试验中构建的实验组和对照组感染模型,结果得出该菌具有致病性。2、鸡致病性沙门氏菌毒力岛核心基因多重PCR检测方法建立依据Gen Bank中已发表关于禽沙门氏菌毒力岛核心蛋白基因SPI-1、SPI-2、SPI-3、SPI-4、SPI-5,经Primer设计的基本原则,选择合适的引物长度,模板引物的含量,发夹结构,Tm控制在50-65℃左右来设计合成合适的引物。进行对鸡致病性沙门氏菌的五个主要毒力岛核心蛋白基因:SPI-1、SPI-2、SPI-3、SPI-4、SPI-5的特异性进行检测。优化多重PCR反应中的条件,如退火温度、引物浓度、镁离子浓度、Taq酶、循环次数,建立多重PCR反应体系进行检测并进行敏感性测定。结果显示:对于SPI-1、SPI-2、SPI-3、SPI-4、SPI-5关键毒力基因特异性检测,置于梯度PCR仪中进行扩增,所得的产物片段的大小与预期目的片段的大小一致。对多重PCR反应体系中的反应条件进行优化并建立多重PCR检测方法,结果为:当引物浓度组合为引物SPI-1浓度为1.0μmol/L,引物SPI-2浓度为1.5μmol/L,引物SPI-3浓度为2.0μmol/L,引物SPI-4浓度为0.5μmol/L,引物SPI-5浓度为1.0μmol/L、退火温度53℃、镁离子浓度2.0mM/mL、Taq酶的量0.25 U、循环次数30次为最佳。多重PCR检测该菌的灵敏度为:101cfu/mL。3、鸡致病性沙门氏菌毒力岛核心基因多重PCR检测方法有效性评价以临床分离的4个沙门氏菌菌株、实验室保存的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的DNA作为模板,以优化后的PCR方法进行SPI-1、SPI-2、SPI-3、SPI-4、SPI-5的检测。分别取PCR扩增的产物4μL,配制1%琼脂糖凝胶,恒压100 V、1 h 5 min电泳进行PCR产物检测,结果可以表明SPI-1、SPI-2、SPI-3、SPI-4、SPI-5五种毒力岛核心蛋白基因在沙门氏菌菌株中的分布情况,验证所建立的多重PCR方法的实用性。检测结果表明,4株是阳性反应。这4株菌均能扩增出131bp、440bp、210bp、282bp、550bp片段,与禽沙门氏菌毒力岛基因SPI-1、SPI-2、SPI-3、SPI-4、SPI-5片段结果相符,同时大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、阴性对照均没有扩增出这些毒力岛基因片段。