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脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)是在镰孢霉属真菌处于缺乏营养的状态下产生的一种次级代谢产物,大麦、小麦、玉米等谷物及其制品是其主要污染物。污染地区遍布全球,其中我国是DON污染较严重的地区之一,尤其是在多雨年份。DON可引起人畜恶心、呕吐、胃部不适、危害生殖系统甚至具有三致(致癌、致畸、致突变)危险,因此近年来世界各国科研人员建立了多种DON的检测方法。其中免疫分析法由于其简单、快速、低成本、高特异性等优点而成为DON检测的重要检测方法。但是像DON这样小分子待测物质免疫学检测过程往往需要制备检测抗原,而传统检测抗原的制备过程往往需要专业的操作人员、复杂的分离纯化过程及使用价格昂贵的DON标准品,同时制备过程中DON毒素和大量有机试剂的使用对操作人员的健康和环境的保护都会产生严重的不利影响。本研究采用噬菌体展示多肽技术,以抗DON单克隆抗体为靶分子,淘选DON多肽模拟表位,采用分子生物学技术合成了DON检测抗原D8-MBP。并基于D8-MBP建立了玉米、小麦、饲料中DON的酶联免疫检测方法(D8-MBP-ELISA)和胶体金免疫层析试纸条检测方法(D8-MBP-GICA)。结果提示D8-MBP可以替代传统DON-BSA抗原用于DON的免疫学检测,实现了DON的无毒、低成本、快速检测。主要研究结果如下:1 DON模拟表位的淘选以抗DON单克隆抗体(anti-DON-Mc Ab)为靶分子,淘选噬菌体随机十二肽库,经过三轮淘选,采取改变洗脱方式(第一轮酸洗脱,第二、三轮DON标准品竞争洗脱)、逐轮降低抗体包被浓度(100μg/m L~50μg/m L)、增加清洗液中的Tween-20浓度(0.1%~0.5%)、逐轮更换封闭剂(BSA、OVA)等措施逐轮增加筛选压,成功获得了一个能与DON标准品竞争结合抗DON单克隆抗体的噬菌体克隆,命名为D8。基于D8建立了Phage-ELISA标准曲线,IC50为44.70±0.88ng/m L,线性范围为8.24~231.19 ng/m L。2 DON全抗原的生物合成PCR扩增D8基因。用Acc65 I和Eag I对目的基因和质粒p Mal-PIII分别双酶切。通过T4 DNA连接酶将目的基因和质粒p Mal-PIII连接以构建表达载体。将表达载体转化至E.coli TB1中诱导表达,纯化后获得了DON全抗原D8-MBP,纯度在80%以上。3分别建立了基于D8-MBP的ELISA(D8-MBP-ELISA)和GICA(D8-MBP-GICA)3.1 D8-MBP-ELISA的建立采用D8-MBP-ELISA分析了p H值、盐离子浓度以及热处理对D8-MBP活性的影响。结果适宜p H值为7.4、适宜盐离子浓度为10 m M,D8-MBP经37℃热处理3 h,活性不会明显降低,但在60℃和90℃条件下随着热处理时间的延长其活性降低明显。D8-MBP-ELISA IC50为57.98±0.97 ng/m L,线性范围为11.32~286.77 ng/m L,最低检测限为9.83 ng/m L,灵敏度比基于DON-BSA建立的ELISA标准曲线(IC50:140.75 ng/m L)提高了近2倍。3.2 D8-MBP-GICA的建立采用两步法合成了海胆状胶体金,经透射电镜表征,直径约为75 nm,粒径较均一。基于海胆状胶体金和D8-MBP建立了D8-MBP-GICA,方法阈值为25ng/m L,相比于DON-BSA灵敏度(阈值:50 ng/m L)提高了1倍。4实际样品的检测分别采用本文建立的D8-MBP-ELISA、D8-MBP-GICA和市售ELISA试剂盒分析了本实验室保存的玉米、小麦、饲料各15个样品中DON的含量,结果显示三种方法检测结果基本一致,其中D8-MBP-ELISA与市售ELISA试剂盒检测结果相关性较好(R2=0.973),提示D8-MBP可以替代传统抗原用于DON的免疫学检测。