论文部分内容阅读
涡虫,扁形动物门(Platyhelminthes)涡虫纲(Turbellaria)动物.涡虫是真正三胚层动物的开始,有内胚层、外胚层和中胚层以及三胚层分化形成的器官和组织.涡虫再生能力极强,不论是纵切、斜切、横切,甚至将涡虫切割成279段,切割后每一部分都具有再生出所有缺失组织的能力.涡虫强大的再生能力使其成为研究再生机制、细胞分化和模式建成的模式生物.对涡虫的研究多集中于涡虫损伤后神经系统再生机制、体轴重建机制和全能干细胞neoblasts干细胞特性的维持等方面,涡虫肌肉发生过程的分子调控机制研究甚少.脊椎动物、爪蟾、果蝇、线虫、文昌鱼等肌肉发生机制研究较多,研究表明MyoD基因家族在肌肉发生过程发挥重要作用. 本文用生物软件MegAlign比对已知MyoD家族cDNA序列保守区,根据比对结果设计基因特异性引物，PCR扩增得到日本三角涡虫肌肉发生决定因子DjMDF保守区cDNA序列.利用RACE技术在已知cDNA片段的基础上,通过向3端和5端延伸扩增的方法,获得DjMDF cDNA序列全长.用生物软件推测DjMDF的氨基酸序列,并对该氨基酸序列作序列比对分析和进化分析.在已知的DjMDF cDNA序列基础上设计带酶切位点的引物,用体外转录的方法得到原位杂交的正义探针和反义探针,斑点杂交确定探针使用浓度及抗体使用浓度.整体原位杂交技术检测切割后再生24h、36h、48h、72h、5day、7day、2week的日本三角涡虫DjMDF基因mRNA表达水平的变化,从而确定DjMDF基因在涡虫肌肉发生中发挥作用. 日本三角涡虫肌肉发生决定因子DjMDF基因cDNA序列全长为1558bp,包括29bp的5’非编码区,1422bp的开放阅读框(ORF),107bp的3’非编码区(3’-UTR).根据ORF区序列用Editsequence软件推测出DjMDF编码的蛋白,为474个氨基酸的DjMDF蛋白.该氨基酸序列中230-314位为bHLH结构域中的basic domain,序列中315-366位氨基酸为helix-loop-helix domain.将得到的DjMDF的氨基酸序列与人、小鼠、果蝇、线虫、爪蟾等MyoD家族进行序列比对,结果表明DjMDF与其它MyoD家族成员一样都有一保守的bHLH结构域.由于MyoD家族是通过保守区形成同源或者异源二聚体,结合在靶基因的启动子上发挥功能,调节与肌肉发生相关的基因表达,由此推测进化上保守的DjMDF,与其他MyoD家族一样参与肌肉发生的调控. 半定量PCR表明,在切割后再生涡虫中DjMDF表达水平较高,再生初期随时间推移DjMDF表达逐渐上升,再生36h达到最高值,随后DjMDF表达水平逐渐下降,但均高于正常涡虫中该基因的表达水平. 整体原位杂交结果表明,DjMDF主要在有肌肉发生过程的细胞或者组织中表达.在再生尾部的头段蓝色信号首先在间质细胞中出现,随再生进行、咽部形成,蓝色逐渐向后集中到咽形成区,也就是DjMDF表达逐渐集中于形成咽的部位;在再生头部的尾端，DjMDF表达类似头段,首先在间质细胞中出现,逐渐向形成咽的区域集中;而在中间片段,蓝色首先在咽部出现,着色清晰、杂交背景低. 涡虫是真正三胚层动物的开始,研究涡虫肌肉发生过程中的分子调控机制,对肌肉组织起源与进化的研究,甚至是动物进化过程中中胚层的起源和分化尤为重要.我们克隆得到日本三角涡虫DjMDF cDNA全序列,对该基因编码的氨基酸序列进行序列比对和进化分析,进一步研究DjMDF在涡虫再生中的表达和功能.