研究背景关节软骨中缺乏血管,因此它的自我修复能力较差,若关节软骨受到损伤,没有接受治疗,软骨缺损将会继续增加,造成软骨合成代谢和分解代谢的紊乱,引起骨性关节炎,病情严重时需要关节置换甚至需要截肢。目前文献报道的软骨缺损修复方法主要有骨软骨移植术、关节清创后微骨折术、软骨细胞移植术等。骨软骨移植术修复软骨缺损疗效较好,但该方法会造成供体区域损伤或功能退化,且供体区域有限,无法修复严重的软骨缺损,具有极大的局限性。微骨折术被报道只对较小的软骨缺损有好的治疗效果。软骨细胞移植术则有着长久的问题未能解决,即软骨细胞的获取难度较大和植入受损部位后的去分化。临床上迫切需要找到更好的治疗方法,同时改善治疗的效果和效率。体外构建功能化组织工程软骨逐渐成为软骨组织工程研究的重要内容。软骨组织工程首先面临的问题是种子细胞的选择,可用于软骨组织工程种子细胞的主要是软骨细胞或间充质干细胞。软骨细胞的获取较为困难,体外扩增时被许多文献报道面临迅速去分化的难题。间充质干细胞如脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带血源性干细胞等都被报道有成软骨分化的潜能。脂肪间充质干细胞是组织工程领域中应用广泛的成体干细胞之一,具有来源获取容易、量大、增殖活性高的优势。与骨髓来源干细胞相比,相同体积的脂肪组织所含干细胞数量是骨髓组织的数百倍,因此脂肪间充质干细胞在软骨组织工程应用等方面前景广阔。在进行体外脂肪间充质干细胞成软骨诱导时,诱导培养基中的几种成分如胎牛血清、ITS、TGF-β3等成分的浓度众说纷纭。体外培养条件下,脂肪间充质干细胞向软骨细胞的分化受到多种因素的影响,在其中力学作用的影响尤为显著。已有许多研究发现,力学刺激可以对成软骨细胞的增殖、分化和细胞外基质变化产生影响。ECM硬度(通常用杨氏模量或弹性模量表示)是细胞重要的外界刺激,对MSCs的成软骨分化起关键的作用。为了观察ECM硬度对成软骨分化的影响需要准备不同刚度且有较好的细胞亲和性的材料。通常改变基质刚度的方法是通过改变其聚合成分的配比,从而制作出有不同力学强度的材料。但是改变基质聚合成分的同时不可避免地会造成表面化学成分的变化,因此研究ECM硬度对接种细胞的影响的核心问题是要找到改变基质刚度的同时不改变其表面的化学成分。机械转导在调节间充质干细胞(MSC)软骨形成中的分子机制尚未完全了解。整联蛋白位于传感路径的开始处,被学者们认为是细胞的的机械传感器。整联蛋白是由18个α亚基和8个β亚基组合而成的异聚跨膜受体,α亚基通常负责结合胞外蛋白,而β亚基通常负责胞内募集调节蛋白。整联蛋白各个亚基中机械敏感的成分及发挥功能的机制尚不明确,目前也需要用适当的动物模型进行更彻底的研究,以阐明在各种疾病和组织再生中机械转导下游靶向信号传递事件的治疗潜力。目的和意义首先探索hASCs成软骨诱导培养基中胎牛血清、ITS、TGF-β3等成分的合适浓度,在验证hASCs成软骨分化的优秀潜能的同时也为后续的实验奠定基础。制备出可调整刚度的聚丙烯酰胺凝胶,观察不同刚度的ECM对hASCs增殖和成软骨分化的影响,最后检测不同刚度的ECM上hASCs整联蛋白的表达情况,为整联蛋白感识外界机械作用的原理提供线索。研究方法1.hASCs提取、培养及3种成软骨培养基的比较2.不同刚度的聚丙烯酰胺水凝胶制备、力学性能检测及细胞增殖检测3.不同刚度聚丙烯酰胺凝胶上hASCs的成软骨分化效果测试结果1.在单层培养或者微球培养时软骨诱导培养基中添加10 ng/ml的TGF-β3并以ITS代替FBS作为细胞培养基添加剂更能促进hASCs的成软骨分化,与此同时,我们也验证了 hASCs成软骨分化的优秀潜能。2.成功制备出3组不同力学性能的聚丙烯酰胺凝胶,测试力学强度,组1凝胶平均刚度为0.67kpa,组2凝胶平均刚度为13.44kpa,组3凝胶的平均刚度为99.31kpa。组1凝胶上的hASCs细胞形态更小,增殖速度组1也更为缓慢。3.3组凝胶上hASCs成软骨诱导3周后检测软骨细胞标志物,观察到组1凝胶上的hASCs成软骨分化水平最高。结论hASCs具有良好的成软骨分化潜能;hASCs成软骨诱导的培养基中选取ITS代替FBS为细胞添加剂更有利于成软骨分化;硬度较低的细胞外基质上的hASCs增殖更慢,但成软骨分化水平更高。