枯草芽孢杆菌S37、S44防治棉花主要土传病害效果及其itu基因克隆

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目的:为了明确实验室前期筛选获得的2株拮抗细菌S37和S44防治棉花主要土传病害的效果和防治机理。方法:通过盆栽试验、小区试验和大田试验测定了拮抗细菌S37和S44对棉苗烂根病和棉花黄萎病的防治效果,并采用形态学和分子生物学方法对其进行了鉴定,对其活性功能蛋白进行了分离、纯化和生理生化特性的测试,同时利用前人报道的枯草芽孢杆菌功能基因的特异性引物,采用PCR扩增的办法,寻找相关功能基因。结果:1.通过盆栽、小区和大田试验,采用拌种和随水滴施2次拮抗细菌S37和S44发酵液的办法,明确了2株拮抗细菌对棉苗烂根病和棉花黄萎病的防治效果和应用潜力,结果表明,在田间小区试验中,S44的相对防效为57%,高于种衣剂福多甲54.5%的相对防效,S37相对防效为47.8%。在重病田中2株拮抗菌发酵液施用后均表现出较好的防治棉花黄萎病的效果,其中S37在143团和147团的防病效果分别为51.3%和55.1%,增产效果分别达到7.43%和17.62%,S44在143团和147团的防病效果分别为35.2%和39.3%,增产效果分别达到5.56%和15.51%。2.对S44抗菌粗蛋白进行了纯化和理化性质测定,结果表明抗菌粗蛋白经120℃处理30min后仍能保持较高的抑菌活性;对蛋白酶K不敏感;紫外照射和可见光均不影响其抑菌活性;经甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等多种有机溶剂处理后活性不丧失;同时该抗菌粗蛋白能有效抑制向日葵菌核病菌、立枯丝核菌、棉花枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、棉花黄萎病菌、番茄早疫病菌6种病菌菌丝的生长。3.以S37和S44的基因组DNA为模板,参考前人文献设计了5对枯草芽孢杆菌特异性引物进行PCR扩增,其中伊枯草菌素基因的特异性引物从S44基因组中扩增到伊枯草菌素基因片段(itu44)。结论:1.两株拮抗菌对棉苗烂根病和棉花黄萎病具有很好的防治效果,通过菌落形态特征观察和16S rDNA分析将2株拮抗细菌S37和S44鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。2.将itu44序列与GeneBank数据库中的相关序列进行比对,结果显示该序列与数据库中已有的枯草芽孢杆菌中分离的伊枯草菌素基因有很高的同源性(84%),表明在S44基因组中可能有相似类型的伊枯草菌素基因。通过比对分析从GeneBank中获得的高同源性序列的保守区域设计1对引物进行PCR,扩增出伊枯草菌素itu44基因的开放阅读框(ORF)。该ORF序列由942个核苷酸组成,编码314个氨基酸。
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