第一部分RNA乙酰化转移酶NAT10在血管新生内膜形成中的作用背景:经皮冠状动脉介入是目前治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的主要方式,但术后再狭窄是临床治疗所面临的重大问题。血管新生内膜的致病机制虽不完全清楚,但已有研究报道RNA修饰在血管新生内膜疾病进展中发挥关键作用。新近研究发现N-乙酰基转移酶10（N-acetyltransferase 10,NAT10）能够对m RNA胞嘧啶进行乙酰化（N4-acetylcytidine,ac4c）修饰,调控m RNA稳定性及翻译效率,但NAT10在血管新生内膜形成中作用及机制尚不清楚。目的:本研究拟在细胞与动物水平上探讨NAT10是否在血管新生内膜形成中发挥调控作用。方法:1使用SD大鼠进行颈动脉球囊损伤构建血管新生内膜形成模型,通过免疫印迹实验对NAT10蛋白定量、斑点实验检测m RNA ac4c修饰水平改变,评估NAT10及m RNA ac4c修饰与血管新生内膜形成的关系。2分离培养大鼠原代VSMCs,使用血小板衍生生长因子诱导VSMCs增殖模型,通过免疫印迹实验对NAT10蛋白定量、免疫荧光染色进行NAT10定位,明确细胞增殖模型中NAT10蛋白表达及定位。3分别构建NAT10敲降及过表达腺病毒,在大鼠颈动脉球囊损伤模型中进行损伤局部干预,通过免疫印迹实验验证干预有效性、苏木素-伊红染色观察损伤处血管新生内膜形成情况及Ki67免疫荧光染色检测细胞增殖指标改变,明确NAT10在血管新生内膜形成中的作用。4构建NAT10 si RNA和过表达质粒,在大鼠VSMCs中分别转染si RNA和过表达质粒后,通过CCK-8、PH3免疫荧光染色实验检测大鼠VSMCs增殖改变;通过划痕、细胞小室实验检测大鼠VSMCs迁移改变;通过Tunel染色、细胞流式实验检测大鼠VSMCs凋亡改变,明确NAT10调控VSMCs增殖、迁移及凋亡等生物学过程。结果:1在大鼠颈动脉血管新生内膜组织中,NAT10表达及m RNA ac4c修饰水平显著增高;血小板衍生生长因子刺激的大鼠原代VSMCs中,NAT10表达明显增加,且定位于细胞核中。2在体敲降大鼠颈动脉血管NAT10表达可抑制血管新生内膜形成,降低细胞增殖、促进细胞凋亡。3在体过表达大鼠颈动脉血管NAT10可促进血管新生内膜形成,促进细胞增殖。4在大鼠VSMCs中敲降NAT10表达可抑制细胞增殖、迁移,促进细胞凋亡、阻滞细胞周期进程。5在大鼠VSMCs中过表达NAT10可促进细胞增殖、细胞迁移。结论:血管损伤后,血管中膜VSMCs高表达NAT10蛋白,且NAT10通过影响VSMCs增殖、迁移及细胞凋亡等生物学过程调控血管新生内膜的发生发展。第二部分NAT10通过乙酰化修饰影响m RNA稳定性及翻译效率调控VSMCs增殖、迁移及凋亡背景:RNA修饰在心血管疾病进展中发挥重要作用,而新近发现的m RNA ac4c修饰能够调控m RNA稳定性及翻译效率,但其在生理与病理过程中的作用研究甚少,在心血管疾病中更无报道。目的:我们拟在细胞水平探讨NAT10是否通过m RNA ac4c修饰影响m RNA稳定性及翻译效率,进而调控血管新生内膜形成。方法:1构建NAT10乙酰化酶结构域突变质粒,转染大鼠VSMCs后,通过CCK-8实验检测大鼠VSMCs增殖改变,明确NAT10通过m RNA ac4c修饰调控VSMCs增殖等生物学过程。2大鼠VSMCs敲降NAT10后,进行转录组、RNA乙酰化免疫沉淀、RNA代谢及核糖体印迹高通量测序,明确NAT10通过m RNA ac4c修饰影响m RNA稳定性、翻译效率,调控VSMCs增殖、迁移等生物学过程。结果:1体外突变NAT10乙酰化酶结构域,过表达NAT10后促VSMCs增殖效应消失。2转录组测序发现,NAT10敲降后差异基因高度富集于调控细胞增殖、细胞死亡等生物学过程。3 ac RIP测序发现,NAT10敲降后m RNA ac4c修饰差异基因高度富集于调控细胞增殖、细胞迁移等生物学过程。4联合分析ac RIP测序和RNA代谢测序发现,NAT10通过m RNA ac4c修饰影响m RNA稳定性,调控VSMCs增殖、迁移等功能。5联合分析ac RIP测序和核糖体印迹测序发现,NAT10通过m RNA ac4c修饰影响m RNA翻译效率,调控VSMCs增殖、迁移等功能。结论:NAT10通过m RNA ac4c修饰影响下游基因稳定性及翻译效率,进一步调控VSMCs增殖、迁移及细胞凋亡等生物学过程。