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丁二酮具有强烈奶油香味,广泛应用于在奶油、酒类等食品、化妆品及烟草工业中。微生物法生产丁二酮是国内外研究的热点,但丁二酮的产量很低,目前的首要研究目标是提高丁二酮的产量。芽孢杆菌是一种食品安全菌株,其丁二酮的代谢生成途径是以葡萄糖为底物经糖酵解转化为丙酮酸,丙酮酸经α[-乙酰乳酸合成酶(a-acetolactate synthase, ALS)催化生成(S)-α-乙酰乳酸,随后经非酶氧化脱羧生成丁二酮；丁二酮可被meso-2,3-丁二醇脱氢酶(meso-2,3-butanediol dehydrogenase, BDH)还原生成(S)-乙偶姻,最后被还原为(2S,3S)-或meso-2,3-丁二醇；同时,(S)-α-乙酰乳酸也可经α-乙酰乳酸脱羧酶(a-acetolactatedecarboxylase, ALDC)直接脱羧产生(R)-乙偶姻,经BDH还原为(2R,3R)-或meso-2,3-丁二醇。即乙偶姻和2,3-丁二醇是丁二酮的竞争性副产物,其与丁二酮共用一个前体物α-乙酰乳酸。本课题以一株高产乙偶姻的芽孢杆菌(Bacilus subspecies DL01,B.sp.DL01)为出发菌株,研究丁二酮代谢途径中关键酶的结构与功能关系、代谢调控机制；同时,运用代谢工程技术,对该菌株丁二酮合成代谢途径进行改造,获得高效的丁二酮生产菌株,结合发酵过程优化等代谢控制发酵技术,实现丁二酮的绿色制造,具体如下：1.丁二酮代谢关键酶BDH的表征克隆了B. sp. DL01的BDH基因budC,与来源于E. aerogenes CICC10293的budC比对,发现两处碱基不同g.27A/T和g.581A/G,其中g.581A/G导致一个氨基酸发生突变p.D194G。将两种不同来源的budC在E.coli BL21(DE3)中表达,纯化后得到BDH,分别标记为D194G-BDH和BDH。采用分子排阻色谱法和MALDI-TOF MS确定其分子量,得出D194G-BDH和BDH都是同源四聚体蛋白。分析D194G-BDH和BDH的酶学性质及酶反应动力学参数,发现D194G-BDH的活性仅为BDH的2.3%,并且丧失了氧化meso-2,3-丁二醇的能力以及利用NADPH辅酶的能力。二者均以乙偶姻/NADH为最适底物,D194G-BDH的Km是BDH的5.63倍。圆二色光谱和native-PAGE分析发现D194G-BDH和BDH具有相似的蛋白质二级结构,均以同源四聚体形式存在。用胰蛋白酶消化两种酶蛋白,发现D194G-BDH对胰蛋白酶十分敏感,表明D194G导致D194G-BDH的构象发生改变,从而活性减弱。选择Klebsiella pneumoniae-BDH的X射线晶体结构(PDB ID:1GEG)为模板,通过同源建模建立D194G-BDH和BDH与底物乙偶姻和辅酶NADH的三维结构,结果发现Asp194不在BDH的催化四联体(Asn-Ser-Tyr-Lys)附近,Gly的短侧链和非极性破坏了Asp194与Gly206, Gly208和Thr209的氮原子之间的氢键和静电相互作用。在B. sp. DL01中重组表达来源于产气杆菌的有活性的BDH,发现B. sp. DL01产生了2,3-丁二醇。通过以上实验确定了BDH的第194位非保守氨基酸Asp被Gly取代是导致D194G-BDH酶活性损失的原因,造成B. sp. DL01高产乙偶姻,不产2,3-丁二醇。2. B. sp. DLO1丁二酮合成途径代谢流的调控采用同源重组敲除ALDC编码基因alsD,构建ALDC敲除菌株B. sp. DL01-ΔalsD,其ALDC没有活性,积累了0.41 g/L丁二酮。向敲除菌株中导入表达ALS基因alsS的重组质粒pHY300PLK-alsS,构建了敲除ALDC并过表达ALS的基因工程菌B.sp.DL01-ΔalsD-alsS,其ALS活性(0.68 U/mg)提高了2.5倍,α-乙酰乳酸的产量由0.58 g/L提高到1.19 g/L,增加了2.1倍,积累了0.53 g/L丁二酮,是B. sp. DL01-ΔalsD的1.3倍。为促进α-乙酰乳酸非酶氧化生成丁二酮,在发酵培养12h后,向培养基中添加20 mMFe3+,丁二酮产量由0.53 g/L增加到1.22 g/L,提高了2.3倍。3.优化发酵培养条件提高丁二酮的产量通过摇瓶发酵,优化了B. sp. DL01-ΔalsD-alsS发酵过程的控制参数和发酵培养基,经摇瓶培养B. sp. DL01-ΔalsD-alsS,在发酵12h后添加20 mM Fe3+,经72 h发酵,丁二酮产量达3.98 g/L。丁二酮的沸点较低,为88℃,采用水回收从发酵罐中挥发的丁二酮。5 L发酵罐,发酵过程中未调控pH(发酵培养基初始pH为6.6)与控制pH为6.6相比,丁二酮产量和发酵效率无明显变化。溶氧对丁二酮产量和发酵效率影响较明显,通气量为0.6 vvm和搅拌转速为200 r/min时的溶氧水平更有利于丁二酮的生成。采用恒底物补料发酵,维持发酵液中葡萄糖浓度在10g/L左右,发酵至48 h,共消耗葡萄糖58 g/L,丁二酮产量达8.69 g/L,产率达0.15 g/g葡萄糖,生产强度达0.18g/(L·h)。本研究发现并证明BDH酶活性的丧失是导致B. sp. DL01高产乙偶姻而不产2,3-丁二醇的原因,随后构建了高产丁二酮的基因重组菌株,最后经恒底物补料发酵使得丁二酮产量达到8.69 g/L。