背景与目的:宫颈癌是全球妇女癌症中仅次于乳腺癌居第四位的癌症,2018年全球宫颈癌发病人数57万例,死亡人数31.1万。宫颈的高危型人乳头瘤病毒（High risk human papillomavirus,HR-HPV）的持续性感染是导致宫颈上皮内瘤变（Cervical intraepithelial neoplasia,CIN）和宫颈癌的直接病因,其中HPV16型的发病率最高,占53%。HPV16 E7蛋白是HPV致癌的关键分子,HPV16 E7蛋白只选择性表达在肿瘤细胞中,随着宫颈上皮内瘤变从CIN1到CIN3进展,HPV16 E7蛋白的表达向外层推进越明显且表达量越来越高,最终HPV16 E7蛋白出现在宫颈脱落细胞中。细胞学检查（如TCT）联合HR-HPV DNA检测,可以增加宫颈上皮内瘤变CIN3、宫颈原位腺癌和浸润性宫颈腺癌的检出率。目前,人乳头瘤病毒（HPV）的临床检测方法主要是基于PCR的方法,但是PCR法只能用于检测HPV DNA和HPV分型,但不能检测HPV E6、E7致癌蛋白,所以预测HPV阳性癌症如宫颈癌的准确率不高。本研究的目的是针对那些细胞学检测为阴性而HR-HPV的DNA检测阳性的妇女,补充检测HPV16 E7蛋白等,即制备抗HPV16 E7蛋白的单克隆抗体并建立在蛋白质水平检测HPV16 E7致癌蛋白的化学发光免疫分析方法等,HPV16 E7蛋白的存在提示宫颈有癌细胞的存在,这很可能在宫颈上皮内瘤CIN2、CIN3时期甚至CIN1时期就发现有癌细胞的存在,具有早期预警宫颈癌的作用。方法:本研究采用基因克隆技术制备HPV16 E7蛋白;用杂交瘤技术制备抗HPV16 E7蛋白的单克隆抗体;测定和分析抗HPV16 E7蛋白单克隆抗体的表征,如单抗的配对、单抗的氨基酸序列和亲和力测定、单抗的优势线性B细胞表位的鉴定和保守性分析等;探索抗HPV16 E7蛋白单抗在免疫化学、免疫荧光、Western Blot等方法中定性检测天然的HPV16 E7蛋白的有效性、特异性及初步诊断价值;探索两个新的抗HPV16 E7蛋白单克隆抗体79A11和69E2（79A11作为捕获抗体,69E2作为检测抗体）被用于基于辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase,HRP）标记检测抗体69E2和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）的常规双抗夹心ELISA法的检测系统,以及基于标记的链霉亲和素生物素（Labelled Streptavidin-Biotin,LSAB）加鲁米诺的化学发光免疫分析法的检测系统,在ng级水平定量检测宫颈内瘤病变CIN和宫颈癌等患者宫颈脱落细胞或组织中HPV16 E7致癌蛋白的诊断价值。主要结果如下:1.HPV16 E7基因的克隆、鉴定和HPV16 E7蛋白的纯化以CaSki细胞中的总DNA为模板,PCR扩增HPV16 E7基因约322bp,重组质粒pET-28a（+）-HPV16 E7中的HPV16 E7蛋白氨基酸序列与CaSki细胞株中的HPV16 E7蛋白氨基酸在第28位氨基酸上不同（28F和28L）,与SiHa细胞株中的HPV16 E7蛋白的氨基酸序列完全一致。工程菌pET-28a（+）-HPV16 E7-Rosetta（DE3）pLysS表达的HPV16 E7蛋白的分子量大约为18 kDa,其表达量高、呈可溶性表达以及二级结构为ɑ螺旋,镍柱亲和层析联合DEAE柱纯化,获得纯度大于95%的HPV16 E7蛋白。2.抗HPV16 E7蛋白单克隆抗体的制备HPV16 E7蛋白免疫BALB/c小鼠的后腿足垫和腹腔5次,细胞融合前的免疫BALB/c小鼠血清的效价在1:128000¹:256000。小鼠腹股沟淋巴结细胞和脾脏细胞分别与SP2/0-Ag14融合后的融合率均为100%。淋巴结细胞来源的效价高的单克隆抗体的亚型主要为IgG2a,包括69E2、69B10、54D5、54F4、54G5,其中的69A6为IgM;脾脏细胞来源的3株效价高的单克隆抗体亚型以IgM为主,以单抗79A11为代表。用二步法-辛酸-硫酸铵沉淀和Protein G纯化的IgG2a亚型的单抗69E2的纯度高达95%以上,69E2的抗体效价最高（0.19ng）;用四步法-硫酸铵沉淀加凝胶过滤层析加IgM柱加凝胶过滤层析纯化的IgM亚型单抗79A11的纯度高达95%以上,单抗79A11的效价较高,大约6.25ng。3.抗HPV16 E7蛋白单克隆抗体的表征8株单抗79A11,69E2,69A6,54D5,54F4,54G5,74F3和72E6通过Western blot方法与一个含有组氨酸标签的人c-Myc（HIS-c-Myc）反应,都没有出现曝光条带,排除这8株单抗与组氨酸标签反应的假阳性。这8株单抗配对56对,出现比较强的阳性信号的单抗对有4对:79A11与69E2、79A11与69A6、79A11与74F3、79A11与54D5。单抗79A11适合作为捕获抗体,单抗69E2、69A6、54D5、74F3适合做检测抗体。测定配对信号强的两对单抗共3个单抗79A11、69E2、69A6是3个新的互相不同的抗HPV16 E7蛋白的单抗,两个单抗79A11与69E2的重链和轻链氨基酸序列的差别都很大。单抗69E2与HPV16 E7蛋白之间的亲和力较高（5.60E-9M）,因为单抗79A11与HPV16 E7蛋白之间结合后被高盐洗脱下来,所以单抗79A11被认为与HPV16 E7蛋白之间没有特异性结合。3个单抗79A11、69E2和69A6的特异性表位均是外露、不连续和位置邻近的3个肽段HPV16 E7_49-66、HPV16 E7_73-85和HPV16 E7_91-97,都是构象性表位。3株单抗79A11、69E2和69A6的3个外露的特异性表位肽段HPV16 E7_49-66、HPV16 E7_73-85和HPV16 E7_91-97的氨基酸序列与从NCBI中下载的30株HPV16毒株中的HPV16 E7蛋白的氨基酸序列的同源性很高。关于3株单抗79A11、69E2和69A6的优势线性B细胞表位不同点有2个:第一是重叠肽的间接ELISA法结果显示单抗69E2与HPV16 E7_85-98的反应有较强的信号（p<0.01）,而2株单抗79A11和69A6与HPV16 E7_85-98的反应没有阳性的信号;第二是重叠肽在10μmol/L时的间接竞争ELISA的结果不同,3株单抗79A11、69E2和69A6抑制重叠肽HPV16 E7_49-66的抑制率依次为40.66%、94.28%和16.28%。这两个不同点提示这3株单抗的优势线性B细胞表位存在差异。4.抗HPV16 E7蛋白单克隆抗体在免疫化学、免疫荧光和Western Blot中的诊断应用8株单抗79A11、69E2、69A6、54D5、54F4、54G5、74F3和72E6在低至7.8125 ng时与CaSki细胞进行免疫细胞化学反应,均出现棕黄色颗粒,而与HeLa细胞反应,不出现棕黄色颗粒;3株单抗79A11、69E2、69A6分别在0.895μg/片、5μg/片和1.84μg/片与HPV16阳性的宫颈癌组织进行免疫组织化学反应,都出现典型的棕黄色颗粒,与HPV18阳性的宫颈癌组织反应,都没有出现棕黄色颗粒;3株单抗79A11、69E2、69A6都在1μg/ml与CaSki细胞进行免疫荧光反应,均出现绿色荧光,而与HeLa细胞反应,不出现绿色荧光。3株单抗79A11、69E2和69A6与CaSki细胞的总蛋白进行Western Blot反应,在18kDa处出现典型的曝光条带,而与HeLa细胞的总蛋白反应,没有出现典型的曝光条带。5.单抗79A11和69E2在基于HRP-69E2和TMB的常规双抗夹心ELISA检测系统中定量检测HPV16 E7蛋白的诊断应用常规双抗夹心ELISA的优化条件为:捕获抗体79A11的最佳包被浓度是2μg/mL,检测抗体HRP-69E2的最佳工作浓度是1μg/mL,5%脱脂乳封闭2 h的本底低和信号强。双抗夹心ELISA结果显示当抗原HPV16 E7蛋白在ng级以等比等差法（0、25、50、100、200、400、600、800、1000 ng/孔）稀释时,制备的直线拟合的参考曲线的决定系数R²=0.9723。以抗原HPV16 E7蛋白在0和变异系数CV低于10%的低浓度25ng含量为横坐标,对应的OD值为纵坐标,获得计算检测限的方程为Y=0.01122*X+0.6896和决定系数R²值=0.9889,以信噪比S/N=3的高标准确定检测下限的OD_450nm=3*0.6896=2.0688,检测限=（2.0688-0.6896）/0.01122=122.9234ng。因为变异系数小于20%,这个检测限也是定量限122.9234ng,所以需要探索灵敏度更高的检测系统。6.单抗79A11和69E2在基于LSAB加鲁米诺的化学发光免疫分析法检测系统中定量检测HPV16 E7蛋白的诊断应用化学发光免疫分析方法的优化条件如下:捕获抗体79A11的包被浓度是2 ug/mL,0.25%BSA封闭液封闭2 h,抗原HPV16 E7蛋白在ng级以等比等差法（0、25、50、100、200、400、600、800、1000 ng/孔）稀释与捕获抗体在37℃反应2 h,检测抗体Biotin-69E2和HRP-Streptavidin的工作浓度都为1 ug/mL,鲁米诺反应10 min等。以优化条件制备参考曲线,其直线拟合的回归方程为Y=53.35*X+10294,直线拟合和双对数拟合的决定系数R²依次为0.9666和0.956;以抗原HPV16 E7蛋白在0和低浓度25 ng的含量为横坐标,对应的相对光度（relative light units,RLU）值为纵坐标,获得计算检测限的回归方程Y=363.1*X+3441,R²=0.9823,信噪比S/N=3的RLU=3*3441=10324,检测限=（10324-3441）/363.1=18.9562ng。因为变异系数小于20%,这个检测限也是定量限18.9562ng,与常规双抗夹心ELISA法定量检测HPV16 E7癌蛋白的定量限122.9234 ng相比,灵敏度提高6.48倍。将标本的RLU值带入方程Y=53.35*X+10294,结果显示4个正常宫颈组织和4例HPV52阳性的宫颈癌组织的总蛋白20μg中的HPV16 E7蛋白含量都小于定量下限18.9562 ng;12例HPV16阳性的宫颈癌组织的总蛋白20μg中的HPV16 E7蛋白含量波动在102.1743⁴38.2473 ng,与正常组织和HPV52阳性宫颈癌组织中的HPV16 E7蛋白含量相比有显著差异（p<0.01）。结论:本研究制备了分子量大约18 kDa、呈可溶性表达、二级结构为ɑ螺旋的HPV16 E7蛋白,获得两株新的不同的抗HPV16 E7蛋白的代表单抗79A11（IgM）和69E29（IgG2a）,单抗79A11和69E2的特异性表位都是构象性表位,分别位于HPV16 E7蛋白二聚体的两个单体上。单抗79A11和69E2在免疫化学、免疫荧光和Western Blot中定性检测天然的HPV16 E7蛋白具有潜在诊断价值。单抗79A11和69E2被应用于基于LSAB-鲁米诺-双抗夹心ELISA的化学发光免疫分析法中,定量检测HPV16 E7蛋白的定量限为18.9562 ng,该化学发光免疫分析法检测12例HPV16阳性的宫颈癌组织中HPV16 E7蛋白的检出率在100%,表明单抗79A11和69E2在化学发光免疫分析法定量检测天然的HPV16 E7蛋白具有潜在的诊断价值。