第一部分：室旁核炎性细胞因子调控交感神经活动和心交感传入反射背景交感神经过度激活是高血压病和慢性心力衰竭(chronic heart failure, CHF)等心血管疾病的重要特征之一,在其病程发展和器官损害中起重要作用。心交感传入反射(cardiac sympathetic afferent reflex, CSAR)是调节交感神经活动和动脉血压的重要心血管反射,在心室表面应用辣椒素、缓激肽(bradykinin, BK)、腺苷或过氧化氢等刺激心交感传入神经末梢均可引起CSAR,直接电刺激心交感传入神经亦可引起CSAR,导致交感神经兴奋和血压升高。下丘脑室旁核(paraventricular nucleus, PVN)是心血管活动整合的重要中枢结构之一,并且是CSAR反射弧中枢通路的重要结构之一。有研究表明急性心肌梗死和心力衰竭大鼠PVN中促炎性细胞因子(pro-inflammatory cytokines, PIC)水平增加,促进交感神经活动增强,并且侧脑室应用细胞因子抑制剂能够减弱心力衰竭状态时交感神经过度激活。然而,PVN中炎性细胞因子,包括PIC和抗炎性细胞因子(anti-inflammatory cytokines, AIC)是否参与调节CSAR尚不清楚。我们过去的研究发现PVN中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)及其1型受体(AT1受体)调控CSAR。有研究发现肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α基因敲除小鼠显著减弱灌注Ang II引起的血压升高等反应。侧脑室灌注AT1受体拮抗剂losartan降低心力衰竭大鼠PVN中PIC水平,提示炎性细胞因子与Ang Ⅱ有相互作用,因此我们推测PVN中炎性细胞因子与Ang Ⅱ的交互作用涉及CSAR、交感神经活动和血压调控。目的1.确定PVN中PIC,如TNF-a和白细胞介素(interleukin,IL)-1β,及PVN中AIC,如IL-4和IL-13是否调控交感神经活动、血压和CSAR。2.确定PVN中TNF-α、IL-1β、IL-4和IL-13是否与Ang Ⅱ-AT1受体协同调控交感神经活动、血压和CSARo3.确定心交感传入活动增多对PVN中TNF-α、IL-1β和IL--4水平的影响。方法实验在去压力感受器神经支配和双侧迷走神经切断的麻醉SD大鼠上进行,采用立体定位仪进行大鼠双侧PVN定位和微量注射,利用Powerlab生物信号采集系统,在体记录肾交感神经放电活动(renal sympathetic nerve activity, RSNA)、平均动脉压(mean arterial pressure,MAP),以心室表面应用BK引起RSNA的变化值作为评价CSAR的指标,采用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定脑组织和血浆炎性细胞因子水平,特异性荧光探针二氢乙啡啶(dihydroethidim,DHE)原位检测PVN中的超氧阴离子。1TNF-α、IL-1β、IL-4或IL-13的剂量效应关系：PVN微量注射saline和不同剂量的TNF-α、IL-1β、IL-4或IL-13(0.1、1和10ng),观察对基础RSNA、MAP和CSAR的效应。2. TNF-α, IL-1β, IL-4或IL-13与Ang Ⅱ的协同效应：PVN微量注射AngⅡ (0.3nmol或3nmol)、TNF-α (1ng或10ng)、IL-1β (1ng或10ng)、TNF-α+Ang Ⅱ和IL-1β+Ang Ⅱ,观察低、高剂量TNF-α或IL-1β与Ang Ⅱ联合应用是否有增强RSNA、升高MAP和增强CSAR效应。另外,观察PVN微量注射亚反应剂量Ang Ⅱ(0.0003nmol)分别与极低剂量(0.1ng)四种炎性细胞因子的协同效应。Ang Ⅱ在TNF-α、IL-1β、IL-4或IL-13注射后立即应用。3. Losartan预处理对Ang Ⅱ、TNF-α、IL-1β、IL-4或IL-13效应的影响：PVN微量注射saline或losartan预处理10min后注射Ang Ⅱ、TNF-α、IL-1β、IL-4或IL-13,观察losartan对上述药物效应的影响。4.心交感传入活动增强对TNF-α、IL-1β和IL-4水平的影响：心室表面反复应用saline或BK三次后颈总动脉快速取血并迅速断头取脑,检测PVN、皮层和血浆中的TNF-α、IL-1β和IL-4水平。5.PVN超氧阴离子水平：PVN微量注射saline、TNF-α或IL-1p后断头取脑,PVN冠状水平切片加入DHE孵育后荧光显微镜观察红色荧光。结果1.PVN微量注射TNF-α或IL-1β剂量依赖性的增加RSNA、MAP和CSAR,且呈线性相关性。IL-4或IL-13仅剂量依赖性的增加MAP,均无显著增强RSNA和CSAR效应。2.低剂量TNF-α或IL-1β (1ng)联合AngⅡ (0.3nmol)在PVN微量注射引起显著强于单独应用TNF-α、IL-1β或Ang Ⅱ的RSNA、MAP和CSAR效应,而高剂量TNF-α或IL-1β (10ng)联合Ang Ⅱ (3nmol)应用时无此增强效应。PVN微量注射saline预处理后,0.0003nmol剂量的Ang Ⅱ对RSNA、MAP和CSAR均无显著影响。应用极低剂量(0.1ng)的TNF-α或IL-1β预处理均使亚反应剂量(0.0003nmol) AngⅡ产生显著增强RSNA、升高MAP和增强CSAR的效应,而极低剂量(0.1ng)的IL-4和IL-13预处理均无此效应。3.PVN应用losartan预处理显著减弱ng Ⅱ、TNF-α和IL-1β的增强RSNA、升高MAP和增强CSAR效应,而对IL-4和IL-13的升压作用无显著影响。4.心室表面反复应用BK刺激显著增加PVN中TNF-α和IL-1p水平,对PVN中IL-4水平无影响,对血浆和皮层中TNF-α、IL-1β和IL-4水平均无影响。5.PVN微量注射TNF-β或IL-1p均增强DHE孵育脑片PVN处红色荧光强度,即PVN微量注射TNF-α或-1β增加超氧阴离子生成。结论PVN中TNF-α和IL-1p增强交感神经活动和CSAR,并升高血压,且与Ang Ⅱ和AT1受体有交互作用。PVN中IL-4和IL-13仅升高血压,对交感神经活动和CSAR均无显著影响。心交感传入活动增强显著升高PVN中TNF-α和IL-1β水平,而不影响IL-4水平。第二部分：延髓头端腹外侧部血管紧张素一(1-7)调控交感神经活动和心交感传入反射背景心交感传入反射(cardiac sympathetic afferent reflex, CSAR)是调节交感神经活动和动脉血压的重要心血管反射,延髓头端腹外侧部(rostral ventrolateral medulla, RVLM)是调控交感神经系统活动和动脉血压的重要中枢部位,直接接受来自下丘脑室旁核(paraventricular nucleus, PVN)的神经纤维投射。我们过去的研究发现RVLM中的活性氧(reactive oxygen species, ROS)介导PVN中血管紧张素Ⅱ (Ang Ⅱ)增强CSAR效应。有研究表明RVLM中存在大量AngⅡ1型(ATl)受体,RVLM微量注射AngⅡ引起AT1受体介导的升压反应。Ang-(1-7)是肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)家族中一种生物活性肽。可由Ang Ⅰ间接形成,或由Ang Ⅱ直接通过血管紧张素转换酶2催化生成。Ang-(1-7)的大多数效应是由不同于经典AT1或AT2受体的一种选择性G蛋白偶联受体-Mas受体介导。尽管有研究证实Ang-(1-7)与Ang Ⅱ在心律失常等方面具有相反的作用,但RVLM微量注射Ang-(1-7)引起的升压效应与Ang Ⅱ的升压效应类似。然而RVLM中Ang-(1-7)与Ang Ⅱ对CSAR和交感活动的作用尚不清楚。Mas受体和AT1受体是否紧张性调控CSAR和交感活动,并介导Ang-(1-7)和Ang Ⅱ的调控CSAR和交感活动作用也不清楚。目的1.确定RVLM中Ang-(1-7)和Ang Ⅱ对CSAR、基础RSNA和MAP的影响。2.确定Mas受体和AT1受体是否调控CSAR、基础RSNA和MAP,是否介导Ang-(1-7)和Ang Ⅱ对CSAR、基础RSNA和MAP的效应。方法实验在去压力感受器神经支配和双侧迷走神经切断的麻醉SD大鼠上进行,采用立体定位仪进行大鼠双侧RVLM定位和微量注射,利用Powerlab生物信号采集系统,在体记录肾交感神经放电活动(renal sympathetic nerve activity, RSNA)、平均动脉压(mean arterial pressure, MAP),以心室表面应用辣椒素(Capsaicin)引起RSNA的变化值作为评价CSAR的指标。1.RVLM微量注射Ang Ⅱ和Ang-(1-7)的剂量效应关系：RVLM微量注射saline和不同剂量的Ang Ⅱ或Ang-(1-7)(0.03、0.3和3nmol),观察对基础RSNA、MAP和CSAR的效应。2. RVLM微量注射AT1受体阻断剂losartan或Mas受体阻断剂A-779的效应：RVLM微量注射saline、Ang Ⅱ(3nmol)、losartan (50nmol)、losartan (50nmol)+Ang Ⅱ(3nmol)、A-779(3nmol)+Ang Ⅱ(3nmol)、Ang-(1-7)(3nmol)、A-779(3nmol)、losartan (50nmol)+Ang-(1-7)(3nmol)、A-779(3nmol)+Ang-(1-7)(3nmol),观察对基础RSNA、MAP和CSAR的影响。结果1. RVLM微量注射Ang Ⅱ或Ang-(1-7)均剂量依赖性的增强CSAR、基础RSNA和MAP。同一剂量的Ang Ⅱ和Ang-(1-7)之间的效应无显著差异。2. RVLM微量注射losartan对CSAR、基础RSNA和MAP均无显著影响。Losartan预处理能消除Ang Ⅱ的增强CSAR和增加基础RSNA和MAP的效应,而A-779预处理无此效应。3. RVLM微量注射A-779显著减弱CSAR并降低基础RSNA和MAP。A-779预处理能消除Ang-(1-7)的增强CSAR和增加基础RSNA和MAP的效应,而losartan预处理无此效应。结论RVLM微量注射Ang-(1-7)与AngⅡ均增强CSAR和交感神经活动,并升高血压。Ang-(1-7)的效应是由Mas受体介导而不是由AT1受体介导的。RVLM中Mas受体而非AT1受体紧张性调控CSAR。第三部分室旁核介导脂肪传入反射调控交感神经活动背景体重超重增加高血压发生风险。肥胖人群交感神经系统(sympathetic nervous system,SNS)活动增强,并与肥胖相关高血压的发生有关。有研究证实白色脂肪组织(white adipose tissue,WAT)存在感觉传入神经末梢。WAT的感觉传入神经的功能还不清楚。有研究发现WAT注射瘦素引起肾交感神经活动(Renal sympathetic nerve activity, RSNA)增强。我们推测可能存在脂肪传入反射参与调控肥胖相关SNS增强和高血压发生。顺行跨突触病毒示踪实验发现WAT感觉传入神经到达调控心血管交感神经活动的中枢部位,例如室旁核(paraventricular nucleus, PVN)、延髓头端腹外侧部(rostral ventrolateral medulla, RVLM)和中间外侧柱(intermediolateral column of spinal cord, IML)。由于PVN下行纤维一部分经延髓腹外侧头端(RVLM)到达IML,另一部分直接下行到达IML,与位于IML的交感节前神经元(sympathetic preganglionic neuron, SPN)构成突触联系,进而调控交感神经活动和动脉血压,是心血管活动整合的重要核团,因此本研究拟探讨PVN在脂肪传入反射中的作用。目的1.确定是否存在脂肪传入反射调控交感传出活动。2.确定刺激白色脂肪组织是否激活PVN,以及PVN是否介导脂肪传入反射。方法实验在麻醉SD大鼠上进行,采用立体定位仪进行大鼠双侧PVN定位和微量注射,用液压推进器推进玻璃微电极记录神经元自发放电。利用Powerlab生物信号采集系统,在体细胞外记录PVN神经元自发放电,以其自发放电频率为观察指标,在体记录RSNA、脂肪神经传入放电活动(adipose nerve afferent activity, ANAA)、平均动脉压(mean arterial pressure, MAP)。除用于c-Fos免疫组化检测大鼠采用戊巴比妥钠麻醉外,其余均应用乌拉坦和α-氯醛糖混合麻醉。腹股沟和／或腹膜后WAT注射辣椒素刺激后,观察ANAA、RSNA和MAP的变化情况,免疫组化法检测脑片PVN处c-Fos阳性神经元表达情况,观察PVN神经元放电变化。另外,PVN微量注射海人酸(Kainic acid, KA)预处理后再应用辣椒素刺激WAT,观察是否阻断脂肪传入反射。结果1.WAT注射辣椒素引起RSNA增强和MAP升高效应。2.WAT注射辣椒素引起ANAA增强。3.WAT注射辣椒素不仅引起PVN神经元c-Fos表达增加,而且增强PVN神经元放电。4.PVN微量注射海人酸预处理消除WAT注射辣椒素引起的RSNA增强和MAP升高效应。结论辣椒素可刺激WAT传入神经末梢,反射性引起交感神经激活和血压升高。PVN在调控脂肪传入反射中起重要作用。