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目的缺血性卒中以其高发病率、高致残率和高死亡率严重危害着人类健康。缺血性脑损伤的病理生理机制极为复杂,其涉及的许多相关基因和蛋白的改变及其复杂的联系尚未研究清楚。脑缺血预处理(BIP)是指对大脑预先进行一次或多次短暂的非致死性缺血刺激后,机体获得对致死性脑缺血的耐受性。BIP的本质是通过激发内源性神经保护机制,促进新的蛋白质合成,从而阻止或减弱脑缺血引起的缺血性级联反应。HSP22是一个哺乳动物小热休克蛋白(sHSPs)家族新成员,在所有肌肉相关组织和脑组织表达,它具有分子伴侣样活性、调节细胞凋亡等作用。本研究采用沙土鼠前脑缺血再灌注模型以及应用BIP进行干预。一方面观察BIP对缺血脑组织超微结构、神经细胞凋亡、HSP22mRNA及蛋白表达以及凋亡相关因子Bcl-2、BaxmRNA及蛋白表达和活化caspases-3蛋白表达变化的影响;另一方面观察BIP对缺血脑组织MAP2、GFAPmRNA及蛋白表达变化的影响,以及通过免疫荧光共聚焦显微镜和免疫金双重标记电镜观察HSP22与MAP2是否在神经元共定位和HSP22与GFAP是否在星形胶质细胞共定位。进一步探讨BIP对沙土鼠脑缺血再灌注后HSP22表达的影响及其神经保护作用。方法1、实验动物模型的制备及分组取健康雄性沙土鼠120只,随机分成正常对照组、假手术组、缺血再灌注(I/R)组和预缺血(IPC)组,I/R组和IPC组又随机分为1d、3d和7d亚组。对照组和假手术组各18只;I/R组和IPC组1d、7d亚组各12只,3d亚组各18只。通过夹闭双侧颈总动脉10分钟的方法建立沙土鼠前脑缺血再灌注模型。IPC组沙土鼠在夹闭双侧颈总动脉10分钟前2天给予间断一天的2次2分钟缺血。2、透射电镜观察BIP对神经组织超微结构的改变。3、TUNEL染色方法检测BIP对脑组织神经细胞凋亡的影响。4、免疫荧光共聚焦方法观察BIP后HSP22分别与神经元细胞骨架蛋白MAP2和星形胶质细胞骨架蛋白GFAP共定位的情况。5、电镜免疫金双重标记方法观察BIP后HSP22分别与神经元细胞骨架蛋白MAP2和星形胶质细胞骨架蛋白GFAP共定位的情况。6、RT-PCR方法检测BIP对脑组织中HSP22、Bcl-2、Bax、MAP2、GFAP基因的mRNA表达的影响。7、Western blot方法检测BIP对脑组织中HSP22、Bcl-2、Bax、caspase-3、MAP2、GFAP蛋白表达的影响。结果1、沙土鼠前脑皮层神经细胞超微结构的变化正常对照组和假手术组前脑皮层神经细胞超微结构正常。I/R组3d亚组可观察到细胞核膜模糊,胞质内线粒体多有嵴减少,外膜局部破坏,粗面内质网轻度扩张。IPC组3d亚组也可观察到上述损伤的神经细胞,但超微结构的损伤明显减轻。2、沙土鼠前脑皮层TUNEL染色结果正常对照组和假手术组沙土鼠前脑皮层几乎未见TUNEL染色阳性细胞。I/R组1d亚组凋亡细胞数较少,3d、7d亚组凋亡细胞数明显增多,且随时间延长,凋亡细胞数逐渐增多。IPC组在1d、3d、7d亚组凋亡细胞数分别较脑缺血再灌注组明显减少(P＜0.05)。3、沙土鼠前脑皮层免疫荧光共聚焦结果HSP22的红色免疫荧光及MAP2的绿色免疫荧光在神经元细胞浆和树突内发生了明显的重叠。HSP22的红色免疫荧光及GFAP的绿色免疫荧光在星形胶质细胞的胞体和突起发生了明显的重叠。4、沙土鼠前脑皮层电镜免疫金双重标记观察结果HSP22免疫金颗粒(10nm)与MAP2免疫金颗粒(15nm)在神经元细胞浆和树突内发生了明显的重叠。HSP22免疫金颗粒(10nm)与GFAP免疫金颗粒(15nm)在星形胶质细胞的细胞浆和突起内发生了明显的重叠。5、HSP22基因的mRNA和蛋白表达结果预缺血组第3d脑组织HSP22mRNA表达与缺血再灌注组比较显著增加(p＜0.05)。预缺血组第1d、3d、7d脑组织HSP22蛋白表达与缺血再灌注组比较显著增加(p＜0.05)。6、Bcl-2、Bax基因的mRNA和蛋白表达结果预缺血组第3d脑组织Bcl-2mRNA表达与缺血再灌注组比较显著增加(p＜0.05),预缺血组第1d、3d、7d脑组织Bcl-2蛋白表达与缺血再灌注组比较显著增加(p＜0.05);缺血再灌注组第3d脑组织BaxmRNA表达与预缺血组比较显著增加(p＜0.05),缺血再灌注组第1d、3d、7d脑组织Bax蛋白表达与预缺血组比较显著增加(p＜0.05);预缺血组第3d脑组织BaxmRNA表达与正常对照组比较差异无显著性(p＞0.05),预缺血组第1d、3d、7d脑组织Bax蛋白表达与正常对照组比较差异无显著性(p＞0.05)。7、活化caspase-3蛋白表达结果预缺血组第1d、3d、7d脑组织活化caspase-3蛋白表达与缺血再灌注组比较显著降低(p＜0.05)。8、MAP2基因的mRNA和蛋白表达结果预缺血组第3d脑组织MAP2mRNA表达与缺血再灌注组比较显著增加(p＜0.05),预缺血组第1d、3d、7d脑组织MAP2蛋白表达与缺血再灌注组比较显著增加(p＜0.05)。9、GFAP基因的mRNA和蛋白表达结果预缺血组第3d脑组织GFAPmRNA表达与缺血再灌注组比较显著降低(p＜0.05);预缺血组第1d、3d、7d脑组织GFAP蛋白表达与缺血再灌注组比较显著降低(p＜0.05)。结论1、BIP能够明显地减轻沙土鼠缺血再灌注后前脑皮层神经细胞超微结构的损伤,减少缺血再灌注后前脑皮层神经细胞凋亡,增加脑缺血再灌注后前脑组织抗凋亡因子Bcl-2mRNA和蛋白的表达,降低活化caspase-3蛋白的表达,而促凋亡因子BaxmRNA和蛋白的表达则没有显著变化。2、BIP能够明显地增加沙土鼠脑缺血再灌注后前脑组织HSP22mRNA和蛋白的表达。3、BIP能够明显地增加沙土鼠脑缺血再灌注后前脑组织神经元骨架蛋白MAP2mRNA和蛋白的表达;HSP22和MAP2共定位于沙土鼠前脑皮层神经元细胞浆和树突。4、BIP能够明显地降低沙土鼠脑缺血再灌注后前脑组织星形胶质细胞骨架蛋白GFAPmRNA和蛋白的表达;HSP22和GFAP共定位于沙土鼠前脑皮层星形胶质细胞的细胞浆和突起。