【目的】　　脆性X综合征（FXS）是一种常见的遗传性智力障碍疾病，脆性X智力低下基因（FMR1）5'末端非编码区 CGG三核苷酸重复数异常及其相邻部位 CpG岛异常甲基化使FMR1编码蛋白 FMRP的缺失是导致该病的主要原因，也有少部分因FMR1基因部分缺失或点突变而致病。FMRP作为一种选择性RNA结合蛋白及翻译调控因子具有调节脑发育和神经元突触可塑性作用，其主要在胞浆中表达，仍有小部分在核内参与DNA修复，micRNA转录后修饰、成熟mRNA的出核转运等重要功能。通常大分子蛋白质进入细胞核发挥功能，需要核输入受体在胞质内识别底物的NLS从而介导入核，有研究已经证实FMRP115—150位氨基酸片段为FMRP的核定位信号区，对FMRP的入核有重要作用，但目前国内外对FMRP具体的入核机制尚不清楚。PABP1是一种mRNA结合蛋白，与FMRP有着非常相似的生物学功能，同样具有核质穿梭功能，参与 mRNA的成熟、翻译、转运等多种功能，有研究证实FMRP与PABP1能共定位在mRNP复合物中。表明 PABP1可能协助了 FMRP入核转运的过程。最近有研究发现 FMR1基因CGG重复拷贝数正常但NLS结构域错义点突变同样能导致FXS。因此对FMRP NLS的结构域及其入核机制的研究将有助于更深入了解 FMRP的功能。综上，本研究拟通过比对物种间FMRP NLS的氨基酸序列，找出人源FMRP NLS可能的关键氨基酸，构建其突变质粒，在培养细胞中分析其对 FMRP入核的影响，以期进一步在体外实验中探索FMRP的入核途径，为研究FXS的发病机理及基因筛查提供新的依据。　　【方法】　　1.采用VectorNTI软件比对人和其它14种物种（包括黑猩猩，猩猩，恒河猴，猪，狗，猫，鲸，兔，豚鼠，小鼠，大鼠，鸭嘴兽，鸡和绿头鸭）间FMRP核定位信号区111-152位氨基酸序列，分析其保守性。　　2.运用生物信息学网站 http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do和http://swissmodel.expasy.org/workspace，为人源性野生型FMRP及人和小鼠间NLS区两个非保守位点分别互换的突变型FMRP（D132E、A145S）建立同源模型，预测比对蛋白空间二级结构。　　3.采用巢式PCR技术，构建表达融合V5标签的野生型人源FMRP的真核表达载体 pCMV-V5-FMRP-WT，并以此为模板，采用定点诱变技术，构建突变型真核表达载体 pCMV-V5-FMRP-D132E，pCMV-V5-FMRP-A145S，均筛选鉴定阳性重组质粒并测序验证。　　4.将野生型pCMV-V5-FMRP-WT及突变型质粒pCMV-V5-FMRP-D132E、pCMV-V5-FMRP-A145S分别转染入人源性HEK293及 NT2细胞，48h后分别提取浆核蛋白，采用Western blot检测并比较野生型与突变体转染细胞中FMRP在细胞核中的分布比值（细胞核/细胞质）的差异。　　5.应用间接免疫荧光法，在共聚焦显微镜下观察野生型FMRP与突变体在HEK293细胞中的亚细胞中定位，并应用ImageJ软件比较FMRP在细胞核中的分布比值核/质荧光值的变化。　　6.转染野生型pCMV-V5-FMRP-WT及突变 pCMV-V5-FMRP-D132E质粒后的HEK293细胞，48h后应用免疫共沉淀（Co-IP）技术及SDS-PAGE电泳，分离切取与野生型与突变型组结合有差异的条带，LC/MS/MS分析差异结合蛋白，利用Western blot鉴定。　　7.利用野生型和突变体差异结合的蛋白的干扰表达质粒（以及相应对照质粒）转染HEK293细胞，转染48小时之后提取细胞浆核蛋白，采用Western blot在蛋白水平上检测对照组和干扰组的内源性FMRP在浆核中的分布。　　8.将干扰表达质粒，以及相应对照质粒转染HEK293细胞，48h后采用RNA免疫共沉淀技术（RIP）分离与内源性FMRP结合的RNA，采用qRT-PCR检测3个候选的FMRP靶基因（DLG4， MAP1B and FMR1）mRNAs与FMRP的结合情况。　　【结果】　　1、各物种间FMRP核定位信号区111-152氨基酸序列，除了132、145位氨基酸不同其余部分保守，132位天冬氨酸（D）出现在人类和其它高等动物中，而132位谷氨酸（E）只出现在小鼠等其它低等动物中；145位丙氨酸（A）只出现在人类，145位丝氨酸（S）则出现在其它物种中。另NCBI网站上查得人FMRP145位氨基酸残基为多态性位点，在正常人群中都含有丙氨酸（A）、丝氨酸（S），。上述结果提示132位氨基酸残基可能为FMRP进化相关的功能位点。　　2、空间二级结构预测显示， D132E的二级结构发生改变，而A145S未出现变化，结果提示D132E空间二级结构的改变可能影响FMRP的功能。　　3、与过表达野生型人源 FMRP（D132）细胞相比，突变体 A145S细胞中FMRP的分布比值（细胞核/细胞质）无显著性差异；而突变体D132E细胞中FMRP的分布比值显著降低（约为野生型组的0.1），差别有统计学意义；进一步采用免疫荧光技术验证，突变体 D132E较野生型 FMRP（D132）在细胞核中的分布明显降低（约为野生型组的18％），差别有统计学意义。表明人FMRP132位天冬氨酸对FMRP的入核起到重要作用。　　4、CO-IP实验联合质谱分析发现，野生型FMRP可结合PABP1，而突变体D132E未见结合。进一步行CO-IP联合Western blot实验，结果发现D132E结合PABP1的能力显著降低（约为野生型 FMRP结合能力的0.1）。上述结果表明FMRP与PABP1能直接结合，而FMRP突变体D132E降低了该结合能力。　　5、在HEK293细胞中干扰PABP1表达的结果显示，干扰表达PABP1后内源性FMRP在细胞核中的分布比值较对照组明显降低（为对照组的0.1倍），差别有统计学意义。该结果表明了PABP1参与了FMRP的细胞核定位。　　6、RIP实验显示，干扰PABP1的表达后，FMRP结合靶基因（DLG4，MAP1B， FMR1）mRNA的能力较对照组发生改变，其中结合DLG4 mRNA的量较对照组减少（约0.5），结合MAP1B mRNA的量较对照组明显增多（约2倍），结合FMR1 mRNA的量无差异。该结果提示PABP1能选择性的改变FMRP结合靶基因mRNA的能力。　　【结论】　　本研究发现了人源FMRP核定位信号区132位天冬氨酸（D）作为一个物种进化相关的功能位点，对FMRP的细胞核定位有重要作用；首次证实了PABP1作为一种FMRP的结合蛋白参与了FMRP的核定位；并进一步证实了PABP1可选择性的调节FMRP靶mRNA的出核转运。为深入研究FMRP的功能和点突变致病的机制提供了新的依据。