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研究目的1阐明耐药性肺腺癌A549细胞的能量代谢状态和主要产能途径。2探究靶向上述产能途径对化疗药物抗肿瘤效果的影响。研究方法1建立肺腺癌耐药细胞系1.1利用顺铂浓度递增的方法,诱导亲本肺腺癌细胞A549建立人耐药性肺腺癌细胞系A549/CR(cisplatin-resistant A549);1.2利用MTS实验验证A549/CR的耐药性。2耐药性肺腺癌A549细胞的能量代谢状态和主要依赖的产能途径2.1采用Cell Titer-Glo?发光法细胞活力检测试剂盒,检测A549与A549/CR细胞的ATP含量,了解耐药性肺腺癌A549细胞的能量状态;2.2利用荧光标记的葡萄糖类似物2-NBDG,比较A549与A549/CR细胞的葡萄糖摄取能力,反映耐药性肺腺癌A549细胞的葡萄糖代谢状态;2.3采用乳酸测定试剂盒,检测A549与A549/CR细胞的乳酸生成量,了解糖酵解的活化程度;2.4在下述不同条件下(1)单独用糖酵解抑制剂2-DG处理,(2)单独用氧化磷酸化抑制剂寡霉素处理,(3)联合应用2-DG和寡霉素处理,利用Cell Titer-Glo?发光法细胞活力检测试剂盒,观察A549与A549/CR细胞ATP含量变化,反映两群细胞对糖酵解和氧化磷酸化的依赖程度。3代谢抑制剂对耐药细胞生存的影响3.1利用MTS实验分别检测浓度为0μmol/m L、10μmol/m L和20μmol/m L的2-DG对A549/CR细胞生存的影响;3.2联合应用不同浓度组合的2-DG和顺铂处理A549/CR细胞,利用MTS实验检测A549/CR细胞活力,反映耐药细胞对顺铂的敏感性变化。结果1成功建立了肺腺癌耐药细胞系A549/CR1.1顺铂连续处理三个月后,A549/CR细胞可在较高浓度(5μg/m L)顺铂的培养基中维持生长;1.2 MTS实验结果显示当顺铂浓度为40μg/m L时,A549/CR细胞的存活率比A549细胞高出约10%,差异有统计学意义(n=4,P<0.001)。2耐药性肺腺癌A549细胞的能量水平较高,主要依赖糖酵解产生能量2.1 A549/CR细胞的ATP含量显著升高,约为A549细胞的1.8倍(n=4,P<0.001);2.2葡萄糖摄取结果显示A549/CR细胞的荧光强度显著高于A549细胞(n=4,P<0.05),说明其摄取了更多的荧光标记的2-NBDG;2.3乳酸生成量结果显示A549/CR细胞的乳酸生成量显著升高,约为A549细胞的1.6倍(n=4,P<0.001);2.4代谢抑制剂对ATP水平的影响如下:(1)单独应用2-DG处理细胞时,A549/CR细胞ATP含量下降了85%(n=3,P<0.001),说明其与A549相比对2-DG的敏感性更高,(2)单独应用寡霉素处理细胞时,A549细胞的ATP水平下降了40%,(n=3,P<0.001),而A549/CR细胞仅下降不到10%;(3)联合应用2-DG与寡霉素处理细胞时,A549/CR和A549细胞ATP含量的变化趋势与单独应用2-DG时几乎相同,说明耐药性肺腺癌A549细胞更依赖糖酵解,而几乎不依赖氧化磷酸化。3代谢抑制剂对耐药细胞生存的影响3.1通过MTS实验可知低浓度(20μmol/m L以下)的2-DG对耐药细胞的增殖无明显影响(n=4,P>0.05);3.2联合用药结果显示较低浓度(10μmol/mL)的2-DG与10μg/mL顺铂联用可使耐药细胞的死亡率增加80%(n=3,P<0.01)。结论1耐药性肺腺癌A549细胞具有更高的ATP水平。2耐药性肺腺癌A549细胞主要依赖糖酵解产生能量。3糖酵解抑制剂可使耐药性肺腺癌A549细胞恢复对顺铂的敏感性。综上所述,能量水平较高的耐药性肺腺癌A549细胞主要依赖糖酵解产生能量,靶向抑制糖酵解可增强顺铂的抗肿瘤效应。