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第一部分胆囊癌患者血清及正常人血清的蛋白质组学分析目的应用比较蛋白质组学方法研究胆囊癌患者及正常人血清之间差异表达的蛋白质,筛选胆囊癌血清标志物以及可能与胆囊癌发病相关的蛋白质。方法利用双向凝胶电泳(2-DE)对6例胆囊癌患者及6例正常人血清的总蛋白进行分离,并用质谱仪对两组间差异蛋白质点进行肽指纹谱和串联质谱鉴定。利用蛋白质印迹分析和免疫组化法检测差异蛋白在胆囊癌患者和健康人血清及组织的表达。结果共有24个蛋白点被成功鉴定。其中在胆囊癌患者血清中高表达的有12个,它们是Splicing factor 3B subunit 5,Cystatin-B,S100A10 Protein,Histone H2B type 2-E, Profilin-1,Eukaryotic translation initiation factor 1A,Isoform 1 of Eukaryotic translation initiation factor 5A-1,FERM domain containing 3 , haptoglobin protein , Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,Serum amyloid P-component precursor,harmonin isoform b3。在胆囊癌患者血清中表达降低的有12个,分别是Apolipoprotein A-I precursor,Myosin regulatory light chain 2,Isoform 1 of Protein canopy homolog 2 precursor,Proteasome subunit beta type-2,ARHGDIA,Superoxide dismutase [Mn],Isoform 1 of Ficolin-3 precursor,zinc alpha-2-glycoprotein 1,HP haptoglobin isoform 2 preproprotein,CD5 antigen-like precursor,CLU clusterin isoform,ITIH4 71kDa protein。Western印迹及免疫组化证实了S100A10蛋白和结合珠蛋白(haptoglobin protein)在胆囊癌患者血清及组织中高表达。结论以2-DE结合质谱鉴定是血清差异蛋白质组学研究的可靠平台。本实验所得的S100A10等差异表达蛋白可能是潜在的诊断胆囊癌的分子标志物或控制肿瘤生长的治疗靶点。第二部分人胆囊癌组织及胆囊良性组织的蛋白质组学分析目的应用比较蛋白质组学方法研究人胆囊癌组织和胆囊良性组织之间差异表达蛋白质。方法利用双向凝胶电泳(2-DE)对6例胆囊癌组织和6例胆囊良性组织的总蛋白进行分离,并用质谱仪对两组间差异蛋白质点进行肽指纹谱和串联质谱鉴定。利用蛋白质印迹分析和免疫组化法检测差异蛋白在胆囊癌组织和胆囊良性组织的表达。结果共有17个蛋白点被成功鉴定。其中在胆囊癌组织中高表达的有9个,它们是AnnexinA3, Phosphatidylethanolamine-binding protein 1(PEBP1),ACTG1 protein,GAPDH,Alcohol dehydrogenase,Fructose-bisphosphate aldolase,Interferon-induced protein with tetratricopeptide,acyl-CoA dehydrogenase,TTR protein;在胆囊癌组织中表达降低的有8个,分别是Superoxide dismutase,Plasma retinol-binding protein precursor,Alpha-crystallin B chain,Hemoglobin,Cathepsin D precursor,Aldo-keto reductase family 1 member B10,Tripartite motif-containing 45,Serotransferrin precursor。Western blot和免疫组化结果显示差异表达蛋白AnnexinA3和Phosphatidylethanolamine-binding protein 1(PEBP1)在胆囊癌组织中表达上调,与2-DE结果一致。结论以2-DE为基础的蛋白质组学技术是肿瘤研究的一种重要手段。本实验所得的AnnexinA3、PEBP1等差异表达蛋白可能成为潜在的诊断胆囊癌的分子标志物或控制肿瘤生长的治疗靶点。第三部分AnnexinA3-miRNA对胆囊癌细胞的生物学效应的研究目的构建针对AnnexinA3的miRNA真核表达载体,并导入胆囊癌细胞,探讨其对AnnexinA3基因的干扰作用以及对胆囊癌细胞生物学效应。方法人工合成AnnexinA3-miRNA的寡核苷酸链,将其插入到pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR载体中;采用脂质体转染法将构建重组体导入人胆囊癌细胞系SGC-996中;采用实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)、免疫印迹法(Western blot)分别检测转染细胞AnnexinA3mRNA和蛋白的表达变化。采用细胞计数法检测实验组和对照组SGC-996细胞的增殖;用流式细胞术(FCM)检测转染AnnexinA3-miRNA载体的SGC-996细胞周期及凋亡;用细胞划痕实验观察各组SGC-996细胞的随意运动能力的变化;利用Transwell小室测定转染AnnexinA3-miRNA载体的SGC-996细胞的穿膜侵袭力。结果成功构建了AnnexinA3的miRNA真核表达载体AnnexinA3-miRNA;转染AnnexinA3-miRNA载体后,SGC-996细胞AnnexinA3 mRNA和蛋白表达均较对照组明显下降(p<0.05)。实验组SGC-996细胞增殖较对照组明显减慢(p<0.05)。干扰前后细胞周期无明显差异(p>0.05),但细胞凋亡明显增加(p<0.05)。干扰后胆囊癌细胞迁移能力明显下降(p<0.05)。实验组穿过基底膜的侵袭细胞数量明显少于对照组(p<0.01)。结论AnnexinA3-miRNA真核表达载体构建成功,转染SGC-996细胞后获得稳定表达,并可特异性封闭AnnexinA3的表达。该载体不仅可抑制SGC-996细胞增殖,诱导SGC-996细胞凋亡,而且还可显著抑制SGC-996细胞的侵袭力,为胆囊癌基因治疗研究提供了实验依据。