背景山西省地处黄河流域中部、华北平原的西侧,四周分别与内蒙古、河北、河南、陕西四省相邻。省内四周山环水绕,大部分地区海拔在1000米左右,全省自北向南分布有6大盆地,地形复杂、气候多样,促成了媒介生物种类的多样性和繁杂性。河南省位于我国中部偏东、黄河中下游地区,属于北亚热带、暖温带气候,这里日照充足、降水丰沛,同样存在种类丰富的媒介昆虫。对山西省和河南省的病毒性脑炎流行病学监测结果显示,在蚊虫活动高峰的夏秋季节,当地存在病毒性脑炎患者。两个省份也一直存在乙型脑炎的病例,其中河南省至今仍为乙脑病例的高度流行区。上一个十年,我国科学工作者分别对山西和河南省进行虫媒病毒病原学调查,分离到乙脑,盖塔,版纳病毒以及发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)等,对于解释当地虫媒病毒感染提供了重要的基础数据。但是10年来,经济的快速发展,农村城镇化,农业生产方式的改变等使得当地虫媒病毒滋生环境发生较大变化,为此,再次开始调查对于了解当地存虫媒病毒种类及分布情况,预测相关病原潜在致病性和致病能力,预防和控制当地虫媒病毒病等方面均具有重要意义。本实验室于2009年在西藏林芝地区墨脱县和米林县开展蚊虫及蚊传虫媒病毒调查工作,在蚊虫标本中分离到两株可以引起BHK-21细胞病变的病毒,本实验对以上两个病毒分离物开展生物学表型、病毒分子鉴定、病毒分子遗传进化研究,以及病毒与当地动物感染性关系等研究。目的本课题通过在山西、河南省、西藏自治区蚊传虫媒病毒的调查研究,掌握当地蚊媒及其携带病毒的种类和分布信息,开展相关蚊传病毒的深入研究,为当地蚊传虫媒病毒病的预防和控制提供本底信息和理论依据。研究方法2012年夏季在山西省、河南省多地采集蚊虫标本,将标本现场分类鉴定后液氮保存,运送至实验室备用。将蚊虫标本,分批研磨离心,取上清接种组织细胞进行培养,对阳性分离物首先使用种属特异引物进行扩增测序,对于未知病毒,使用454高通量测序等技术获得序列信息,使用Clustal X2.1、MegAlign、Genedoc3.2和Mega v5.1生物信息学软件进行病毒核苷酸和氨基酸序列比对及系统进化分析；使用马尔科夫蒙特卡洛方法,对我国新分离双链RNA病毒(环状病毒和Seadornavirus属病毒)进行系统进化分析及病毒共同进化祖先分析(tMRCA).结果1、山西省蚊传病毒分离鉴定本研究于2012年夏季,在山西省运城市临猗县和永济市8个乡镇设立19个采集点,共采集蚊虫10455,经鉴定分为4属7种,其中库蚊属两种：淡色库蚊、三带喙库蚊；伊蚊属3种：背点伊蚊、白蚊伊蚊、刺扰伊蚊；按蚊属1种：中华按蚊；阿蚊属1种：骚扰阿蚊。不同地区的蚊种构成和优势蚊种存在明显差异,临猗县优势蚊种为淡色库蚊(91.96%,3911/4253)；永济市优势蚊种为三带喙库蚊(72.85%,4518/6202)。本研究中共使用5种诱蚊灯(器材),其中功夫小帅和CDC诱蚊灯采蚊效果最佳,能够满足捕捉蚊虫数量和种类的多样性。采用组织细胞培养法,将10455只蚊虫标本按照蚊种、采集工具和采集时间地点分190批进行研磨,上清接种细胞连续传代3次,结果分离到23株阳性分离物,来自于4个蚊种。包括三带喙库蚊、淡色库蚊、白蚊伊蚊和骚扰阿蚊。经过分子生物学鉴定,共得到15株乙脑病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)、4株库蚊黄病毒(Culex Flavivirus, CxFV)、3株淡色库蚊浓核病毒(Culex pipiens pallens densovirus, CppDNV)和1株盖塔病毒(Getah virus, GETV)从三带喙库蚊和淡色库蚊中分离到病毒最多,分别是12株和10株,其中三带喙库蚊中乙脑病毒的批次阳性率和现场最低感染率最高,分别为14.1%和1：405。所有JEV病毒均为经过C6/36细胞扩增培养后,转接BHK21、Vero细胞可导致二者出现细胞病变效应(Cytopathic effect, CPE)。对新分离病毒进行分子生物学特征分析显示,15株JEV均为基因Ⅰ型病毒,各分离株之间E基因核苷酸和氨基酸序列同源性为99.6%～100%和99.80%～100%。新分离株与疫苗株SA14-14-2在E基因区段存在11处共同的氨基酸差异,但差异位点均不处在决定抗原性的关键氨基酸位点。首次从山西省分离到4株CxFV,各分离株之间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.9%-100%和99.8%-100%,系统进化分析显示山西分离株与我国山东分离株亲缘关系最接近,其次与辽宁株较为接近。本研究中GETV亦为山西省首次分离,该毒株与我国上海2005年GETV分离株遗传关系相近,二者E2基因之间的核苷酸和氨基酸序列同源性在99%以上。2、河南省蚊传病毒分离鉴定本研究于2012年5月～8月在河南省洛阳市新安县、信阳市息县采集蚊虫标本,共采集淡色库蚊、骚扰阿蚊、三带喙库蚊、中华按蚊、白蚊伊蚊4属5种共计7149只蚊虫标本。其中洛阳市新安县的优势蚊种为骚扰阿蚊,淡色库蚊是信阳市息县优势蚊种。对所有标本分170批进行研磨和病毒分离,结果分离到5个阳性分离物均为JEV,其中2株来自于三带喙库蚊,3株分自于淡色库蚊。新分离病毒的分子生物学特征分析显示,所有5株JEV均为基因Ⅰ型病毒,分离株之间E基因核苷酸和氨基酸序列同源性为98.6%～99.9%和99.8%～100%。新分离JEV与疫苗株SA14-14-2在E基因区段存在11处共同的氨基酸差异,差异位点均未处于决定抗原性的关键氨基酸位点。与山西省JEV分离株相同,该5株JEV是经过C6/36细胞培养扩增后再接种BHK21,Vero细胞才可增殖并导致哺乳动物细胞CPE。3、西藏新分离环状病毒的鉴定及系统进化分析在中国西藏采集的多斑按蚊中分离到两株病毒(XZ0906、XZ0923),可引起哺乳动物细胞(BHK-21)圆缩、破碎；不能致昆虫细胞(C6/36)明显病变但可以在该种细胞中复制。聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)结果提示两株分离物均为10节段双链RNA病毒,RNA带型完全一致,均为3-3-3-1布局。使用454高通量测序技术初步测定两株病毒各节段核酸序列,结合5’RACE、3’RACE及Sanger测序技术完成毒株XZ0906全基因组(Seg1-Seg10)核苷酸序列测定(GenBank登录号：KF746187to KF746196),序列分析显示XZ0906基因组全部10个节段RNA序列的5’、3’非编码区末端6个核苷酸序列均各自保守(5’-GUAAAA-----ACUUAC-3’)。与其他已报道环状病毒代表株相比较,XZ0906各基因节段氨基酸序列均差异较大,其中VP3(T2)蛋白氨基酸序列同源性仅为22.9-75.9%。基于呼肠孤病毒VP1蛋白氨基酸序列分子遗传进化分析结果,XZ0906病毒属于环状病毒属成员,进一步对环状病毒属病毒T2蛋白氨基酸序列进行系统进化分析,结果显示XZ0906不属于任何一种已知环状病毒,为呼肠孤病毒科环状病毒属新成员,定名为西藏环状病毒(Tibet orbivirus, TIBOV).对XZ0906和XZ0923的10个基因节段比较分析,发现除第6、2节段氨基酸同源性仅为80.39%和39.16%以外,其余各节段氨基酸同源性均大于94%,其中第3、5节段达到100%,T2蛋白氨基酸同源性为100%,提示两株病毒为同一种环状病毒。对同期在当地采集的66份健康猪血清进行IFA检测,结果提示当地家猪血清标本TIBOV IgG抗体阳性率为14.0%(8/57)。本研究采用贝叶斯马尔科夫蒙特卡洛方法,对包括TIBOV在内的12种、78株环状病毒属成员的VP1蛋白氨基酸序列数据集进行分子遗传进化分析,通过对Orbivirus病毒属病毒分歧时间分析发现,Orbivirus病毒属最近共同祖先(Time to most recent common ancestor, tMRCA)约出现在5051年(置信度1984～8893年)以前,其中西藏环状病毒TIBOV出现在大约距今43年前,与分离自澳大利亚的EUBV病毒具有较近的亲缘关系,并与主要由蠓携带传播的EHDV,BTV, EEV等能够引起家畜疾病和死亡的的虫媒病毒处于同一进化分支。4、其他工作对我国新分离Seadornavirus病毒属进行病毒分子遗传进化分析。基于LNV第10节段碱基替换值推算,LNV最近共同进化祖先出现时间分别在距今约316(95%HPD为70-800)年前,其中最早进化出现的为吉林分离株NE9731；基于BAV第12节段碱基替换值推算其最近共同进化祖先出现时间约在距今241年(95%HPD为89-500)前,我国最古老的BAV应当属于中国南方分离株,即中国云南分离株。结论及意义本课题对山西、河南省部分地区开展蚊传虫媒病毒调查。在山西省分离到4种病毒,其中CxFV和GETV均为山西省首次分离到；在河南省蚊虫标本分离到5株乙脑病毒,山西和河南两省蚊虫标本中分离JEV均为基因Ⅰ型。本研究结果显示,乙脑病毒仍然是山西、河南两地蚊虫携带的最主要的虫媒病毒,以上研究结果对当地虫媒病毒病的防控具有重要意义。同时,本课题通过病毒生物学和病毒分子遗传进化分析首次阐明我国西藏分离的两株病毒为环状病毒新种(TIBOV),病毒基因组信息已经提交至基因库(GenBank)注册。研究结果还提示,西藏当地家猪血清标本中存在西藏新分离环状病毒的IgG抗体,提示该病毒与当地动物感染有关,本结果为当地动物疾病的预防控制提供了基础数据。