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油菜作为世界上种植最为广泛的油料作物之一,是人类食用油和畜牧饲料的主要来源,但是在油菜的整个生育期内会面临很多生物胁迫和非生物胁迫,严重影响油菜的产量和品质。研究表明,转录因子调控基因表达,在植物胁迫应答中起关键性作用。其中ERF转录因子广泛存在于各类植物中,许多研究也表明在植物中过量表达ERF转录因子,可以激活下游相关抗性基因的表达,来提高植物的抗逆性和抗病性。本实验根据前期转录组测序结果-黑胫病菌(Leptosphaeria biglobosa)诱导甘蓝型油菜叶片4 d后,表达上调的转录因子BnERF019,对该基因进行表达分析和功能鉴定,得出如下结论:1.以油菜真叶接种Leptosphaeria biglobosa 4 d后提取RNA,反转录cDNA为模板,克隆得到Bn ERF019转录因子的CDS序列,测序后该转录因子CDS序列为453 bp,与转录组测序结果中的序列(ID=Bna C07g13470D)进行比对,100%一致。利用CLC sequence viewer 6.0推导BnERF019基因编码蛋白的氨基酸序列,编码151个氨基酸,分子量为16.38 KD,理论等电点为6.27,并预测其蛋白二级结构、磷酸化位点、跨膜结构和亲疏水性。2.基于实时荧光定量PCR分析接种黑胫病菌4 d、5 d和6 d后的油菜根、茎、叶的相对表达量。结果显示该转录因子在油菜的根、茎、叶中均有表达。在接种黑胫病菌4 d,5 d和6 d基因都有表达。第5 d根茎中的相对表达量达到最高,第6 d叶中的相对表达量达到最高。说明Bn ERF019转录因子在油菜抗黑胫病(Leptosphaeriabiglobosa)中发挥着重要的作用。3.亚细胞定位结果表明,BnERF019蛋白集中分布在细胞核,而空载体p YBA-1132在细胞核、细胞质和细胞膜中均有分布。4.为了验证基因BnERF019的功能,构建过表达载体pYBA-1143-ERF019,转化农杆菌GV3101感受态细胞。通过农杆菌介导的侵染花序方法将重组质粒pYBA-1143-ERF019转入野生型拟南芥。经过卡那霉素抗性筛选和PCR检测鉴定后,获得了T1代转基因拟南芥6株。5.转基因拟南芥进行离体叶片接种法鉴定黑胫病抗性,结果表明,随着接种黑胫病菌天数的延长,转BnERF019基因的拟南芥与野生型拟南芥相比,叶片病斑面积明显较小,腐烂程度也明显较低。说明BnERF019显著提高了对黑胫病菌的抗性,且Bn ERF019以正向调控方式参与植物的防御反应。