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目的:肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS)是一种慢性进行性致死性的中枢神经系统变性疾病,以选择性侵犯脑和脊髓运动神经元为特征,临床表现为进行性的肌肉萎缩,最终因呼吸肌麻痹而死亡.其起病隐袭,缓慢进展,确切的发病机制至今不明,目前尚无有效的治疗方法.研究表明ALS发病与神经系统炎症有关,其过程主要由激活的小胶质细胞和星形胶质细胞及其释放的活性物质诸如细胞因子、趋化因子和生长因子所介导的多种细胞之间复杂的相互作用所引发,研究发现JAK2可以和多种炎症细胞因子结合并发挥不同作用,并且多种类型的细胞中已经证实JAK参与了促炎因子的调节.但目前在神经变性疾病中基于JAK2的研究很少,本实验探究了JAK2及其激活形式p-JAK2在ALS转基因模型小鼠整个发病过程中的表达变化,为JAK2在ALS疾病进程中的作用提供依据,以揭示ALS的发病机制,并为ALS治疗提供可能的靶点. 方法: 1 SOD1-G93A转基因小鼠的繁殖及鉴定 实验用ALS模型小鼠饲养在恒湿、恒温、白天/黑夜(12h)交替照射的清洁环境中,喂以生长型鼠粮以及充足的饮水.该小鼠由购自Jackson实验室(Bar Harbor,ME,USA)的B6SJL-Tg (SOD1-G93A)1 Gur/J雄鼠和 B6SJL/F1 雌鼠杂交而来,在小鼠生后21d左右提取DNA,通过凝胶电泳、GBOX-HR 全自动凝胶成像系统鉴定出带有人类SOD1突变基因的转基因小鼠. 2 转基因小鼠运动功能评分 小鼠运动缺陷评分采用4分评价系统: 1)正常,无运动障碍及体重减轻:评4分 2)悬尾出现后肢震颤:评3分 3)步态出现异常:评2分 4)至少一侧出现后肢瘫痪:评1分 5)仰卧或侧卧,30秒内不能翻正:评0分 临床发病(onset):每周称2次体重,当体重连续两次下降并出现步态异常,评分2分.终末期:侧卧30秒不能翻身,评分为0分. 3 实验分组 将SOD1-G93A小鼠分为六组:30d组;60d组;90d组;onset组;终末期组及非转基因对照组(130d左右),每组6只. 4 组织处理与免疫组织化学染色 4.1 组织处理 各组取3只小鼠,麻醉后行PBS、4%多聚甲醛灌流固定,取脊髓腰膨大部位固定24h后经30%蔗糖脱水、OCT包埋,使用冰冻切片机切成25μm组织切片待用. 4.2 免疫组织化学染色 1%H2O2处理 10min,TBS漂洗10min,血清封闭1h,一抗(JAK2、p-JAK2)孵育4℃过夜,TBST漂洗,生物素二抗孵育1h,漂洗,三抗孵育40min,漂洗,DAB显色,铺片,脱水5min,透明10min后封片,显微镜观察结果并拍照. 5蛋白印迹 新鲜取终末组SOD1-G93A和对照组小鼠腰膨大部位,经液氮冷冻后于-80℃保存,提取总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,蛋白上样量50μg,经SDS-PAGE电泳后转膜,BSA封闭,一抗(抗JAK2、p-JAK2抗体)孵育,漂洗,荧光二抗孵育,漂洗,Odyssey成像系统扫膜后分析数据. 6统计分析 数据用(x)±SEM表示,采用SPSS 18.0统计学软件对数据进行统计处理.两组之间的比较应用两独立样本t检验.P<0.05为有显著差异,有统计学意义. 结果: 1. JAK2在非转基因小鼠和ALS转基因小鼠发病前期的腰髓中表达均较少,随疾病进展,JAK2表达逐渐增多,终末期ALS小鼠JAK2表达明显增加. 2. 在非转基因小鼠和发病前的ALS转基因小鼠,p-JAK2主要表达于运动神经元胞浆,发病后主要表达在增生的胶质细胞. 3. 与非转基因小鼠相比,终末期ALS转基因小鼠腰髓p-JAK2表达量明显增加. 结论: 在ALS转基因小鼠发病过程中,JAK2及其激活形式p-JAK2表达上调,并且ALS转基因小鼠发病后,p-JAK2主要表达在增生的胶质细胞,提示JAK2/p-JAK2可能在ALS发病过程中起重要作用.