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第一部分核因子κB和uPA在人膀胱移行细胞癌中的表达及临床意义目的核转录因子-κB(NF-κB)的激活是恶性肿瘤演变过程中的一个重要起始环节,其家族蛋白被认为与肿瘤的发生、发展,侵袭转移和预后有关。本试验研究不同因素人膀胱移行细胞癌组织中NF-κB和尿溶酶纤溶酶激活剂(uPA)的表达情况,评价两者之间表达的相关性,探讨NF-κB在膀胱癌发生、发展中的作用。方法应用免疫组织化学二步法检测38例膀胱移行细胞癌和10例非癌膀胱粘膜标本中NF-κB p65和uPA蛋白的表达情况,同时结合患者的性别、年龄、临床分期、病理分级、初发还是复发、有无淋巴结转移等因素进行分析,判断上述因素对膀胱癌组织中NF-κB p65和uPA表达的影响,并分析NF-κB p65表达和uPA之间的相关性。结果38例膀胱癌组织中NF-κB p65阳性率为71.1%(27/38),10例非癌膀胱粘膜标本中NF-κB p65阳性率为10%(1/10),NF-κB p65的过度活化与膀胱癌淋巴结的转移(P<0.01)和病理分级(P<0.05)有关,而患者性别﹑年龄、肿瘤复发和临床分期等因素对NF-κB p65的表达无明显影响;肿瘤组织uPA的表达明显高于良性病变组织(P<0.01),uPA与肿瘤病理分级(p<0.05)、临床分期(p<0.05)和淋巴结的转移(P<0.01)密切相关;经Spearman相关分析显示,在不同恶性程度的膀胱癌中,NF-κB p65表达与uPA之间呈正相关(r=0.89、P<0.01)。结论NF-κB可能通过上调与肿瘤侵袭转移有关的因子(如PA)的表达,有助于肿瘤的恶性演变。NF-κB的过度活化可能在膀胱移行细胞癌的恶性进展,侵袭转移中发挥重要作用,可能成为未来膀胱癌的治疗中的一个重要靶子。第二部分核因子-κB圈套策略—CD-ODN对膀胱癌细胞系BIU87生物活性的影响一、核因子-κB圈套策略—CD-ODN对膀胱癌细胞系BIU87增殖力和侵袭性的影响目的研究NF-κB环状哑铃型圈套寡核苷酸(CD-ODN)转染对NF-κB活性和膀胱癌细胞BIU87增殖活性和侵袭力的影响,探索膀胱癌基因治疗的新靶点。方法激光共聚焦法观察BIU87细胞内NF-κB核转位的情况,脂质体介导法将CD-ODN体外转染BIU87细胞(CD-ODN-BIU87),以转染了CD-ODN突变体(CD-ODN-mut)的BIU87细胞(CD-ODN-mut-BIU87)和仅转染空脂质体的BIU87细胞为对照;将携有4个NF-κB的串联重复识别元件的荧光素酶报告基因重组质粒(pNF-κB -LUC+)和β-半乳糖苷酶表达质粒(PCMV-β-gal)转化大肠杆菌DH5α并扩增、抽提、纯化,然后将其与CD-ODN瞬时共转染入BIU87细胞,检测不同处理组NF-κB活性的改变;并用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)和细胞侵袭小室分别检测不同处理组BIU87细胞体外增殖和侵袭活性的变化,细胞克隆形成试验检测CD-ODN对BIU87细胞系干细胞的影响。结果激光共聚焦技术显示,膀胱癌细胞系BIU87中存在明显的NF-κB过度核转位;荧光素酶报告质粒的方法证实CD-ODN-BIU87细胞组NF-κB的活性明显低于转染其突变体组和对照组;MTT发现,CD-ODN-BIU87细胞在第24、48、72和96小时的吸光度值A明显低于两对照组(P<0.01或p<0.05),以正常BIU87细胞为对照,CD-ODN-BIU87在第24、48、72和96小时的细胞生长抑制率分别为27%、46%、28%和11%;细胞侵袭试验显示,CD-ODN-BIU8细胞组、BIU87细胞组和CD-ODN-mut-BIU87细胞组细胞浸润穿透ECM层的数目分别为8.5±1.3、25.4±2.6和24.7±2.1,CD-ODN-BIU87细胞组明显少于两对照组(P<0.05);细胞克隆形成试验显示细胞经ODN干预并继续培养一周后,CD-ODN组、对照组和CD-ODN-mut组的克隆形成数目分别为26.3士3.2、52.3士4.5和48.7士3.1,克隆形成率分别为(8.8±1.1)%、(17.4±1.5)%和(16.2±1.0)%,CD-ODN组与两对照组比较差异有显著性(P<0.01)。结论膀胱癌细胞系BIU87中存在NF-κB的过度活化,CD-ODN能明显的抑制NF-κB和DNA的联结活性,降低膀胱肿瘤细胞体外增殖活性和侵袭力,为基因治疗膀胱肿瘤提供了新的思路。二、核因子-κB圈套策略—CD-ODN对膀胱癌细胞系BIU87凋亡的影响目的研究NF-κB环状哑铃型圈套寡核苷酸(CD-ODN)转染对NF-κB活性和人膀胱癌细胞系BIU87凋亡的影响,探索膀胱癌基因治疗的新途径。方法脂质体介导法将NF-κB新型诱骗剂CD-ODN体外转染BIU87细胞(CD-ODN- BIU87),以转染了CD-ODN突变体(CD-ODN-mut)的BIU87细胞(CD-ODN-mut-BIU87)和仅转染空脂质体的BIU87细胞为对照;将携有4个NF-κB的串联重复识别元件的荧光素酶报告基因重组质粒(pNF-κB -LUC+)和β-半乳糖苷酶表达质粒(PCMV -β-gal)转化大肠杆菌DH5α并扩增、抽提和纯化,然后将其与CD-ODN瞬时共转染入BIU87细胞,检测不同处理组NF-κB活性的改变;流式细胞仪检测各组细胞早期凋亡和细胞周期的变化。结果荧光素酶报告质粒的方法证实CD-ODN-BIU87细胞组NF-κB的活性明显低于转染其突变体组和对照组;流式细胞仪Annexin V/PI双染色法检测发现ODN转染细胞48小时后,CD-ODN-BIU87,CD-ODN-mut-BIU87和BIU87的细胞凋亡率分别为(15.81±0.36)%,(6.76±0.96)%和(5.21±0.71)%。经统计学分析,CD-ODN-BIU87细胞的细胞凋亡率明显高于其它两对照组(P<0.01);细胞周期的检测显示, ODN转染细胞48小时后,CD-ODN-BIU87、CD-ODN-mut-BIU87和BIU87处于细胞周期G0-G1期的细胞数目分别为(42.34±2.91)%、(20.34±1.99)%和(16.28±2.26)%,CD-ODN-BIU87停滞于G0-G1期的细胞数目明显多于其它两组(P<0.05),上述三组细胞处于S期的细胞数目分别为(42.68±2.51)%、(60.06±2.61)%和(65.12±4.45)%,而CD-ODN-BIU87处于S期的细胞数目明显少于其它两组(P<0.05)。结论CD-ODN能特异性抑制BIU87肿瘤细胞内NF-κB活性,促进肿瘤细胞早期凋亡,对肿瘤细胞产生G1-S阻滞作用。这提示,CD-ODN可能通过阻断NF-κB信号转导通路来调控细胞周期,促进肿瘤细胞的早期凋亡,而以NF-κB为靶点的基因治疗有其可行性。第三部分NF-κB圈套策略CD-ODN对膀胱癌细胞系BIU87NF-κB信号通路的作用目的探讨NF-κB的活化与尿溶酶纤溶酶激活剂(uPA)和Bcl-2——两个被确认与肿瘤细胞的侵袭转移和凋亡有关的因子——之间的关系,进一步揭示膀胱癌的形成机制,探讨膀胱癌基因治疗的新途径。方法脂质体介导法将NF-κB新型诱骗剂CD-ODN体外转染BIU87细胞(CD-ODN-BIU87),以转染了CD-ODN突变体(CD-ODN-mut)的BIU87细胞(CD-ODN-mut-BIU87)和仅转染空脂质体的BIU87细胞为对照;将携有4个NF-κB的串联重复识别元件的荧光素酶报告基因重组质粒(pNF-κB -LUC+)和β-半乳糖苷酶表达质粒(PCMV-β-gal)转化大肠杆菌DH5α并扩增、抽提和纯化,然后将其与CD-ODN瞬时共转染入BIU87细胞,检测不同处理组NF-κB活性的改变;PCR检测ODN转染24小时后各处理组uPA mRNA表达情况,Western-blot检测各处理组uPA和Bcl-2蛋白的表达情况。结果荧光素酶报告质粒的方法证实CD-ODN-BIU87细胞组NF-κB的活性明显低于转染其突变体组和对照组;PCR检测发现BIU87细胞中uPA mRNA呈强表达,转染CD-ODN后表达明显被抑制,而转染其突变体无此作用;Western-blot检测显示在BIU87和CD-ODN-mut-BIU87细胞中均有uPA和Bcl-2蛋白的明显表达,而在CD-ODN-BIU87细胞中这两种蛋白的表达被明显抑制。结论uPA和Bcl-2基因上均含有NF-κB的结合位点,NF-κB诱骗剂CD-ODN能抑制uPA和Bcl-2等与肿瘤的增殖、凋亡、侵袭和转移有关的因子的表达,可能是通过特异性的抑制NF-κB的活性来实现的,为开发新的基因治疗膀胱癌药物提供了理论依据。