miR-200b对炎症性肠病肠上皮屏障的影响及调控机制

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目的探究miR-200b对肠上皮细胞IL-8分泌和肠上皮细胞间紧密连接的影响,补充和完善miR-200b对肠上皮屏障的调控机制。方法收集溃疡性结肠炎(UC)患者肠黏膜标本10例,Real-Time PCR检测miR-200b及IL-8表达,分析二者的相关性。分别利用重组慢病毒miR-200b-pGCSIL和阴性对照慢病毒转染Caco-2细胞;以10 ng/mL肿瘤坏死因子α(TNFα)处理细胞建立体外肠上皮炎症模型;将细胞分成4组:200b组、200b+TNFα组、NC组(阴性对照组)和NC+TNFα组。Real Time PCR、ELISA方法检测IL-8表达;Western Blot方法检测P-JNK、P-C-JUN和Total C-JUN表达。分别用miR-200b-GV268质粒和AP-1质粒共转染Caco-2细胞,miR-200b和C-JUN 3’UTR-GV306质粒共转染293T细胞,双荧光素酶报告基因系统分别检测AP-1和C-JUN荧光活性。将Caco-2细胞接种于transwell板建立体外肠上皮屏障模型。测定肠上皮跨膜电阻抗(TEER)及其对异硫氰酸荧光素-右旋糖酐(FITC-dextran)的通透量;Western Blot方法检测肌球蛋白轻链激酶(MLCK)及磷酸化肌球蛋白轻链(P-MLC)表达。结果1 miR-200b对肠上皮细胞IL-8分泌影响1.1与病变旁黏膜相比,UC患者病变黏膜处miR-200b下调(P<0.05),IL-8 mRNA表达则上调(P<0.05),二者呈显著负相关(R=-0.6612,P<0.05)。1.2与NC组相比,NC+TNFα组和200b+TNFα组的IL-8 mRNA和蛋白表达均显著升高(p<0.05),但200b+TNFα组IL-8表达显著低于NC+TNFα组(P<0.05)。与NC组相比,200b组C-JUN表达量、C-JUN 3’UTR荧光活性和AP-1荧光活性均显著降低(P<0.05)。与NC+TNFα组相比,200b+TNFα组P-JNK、P-C-JUN、Total C-JUN表达量和AP-1荧光活性分别在15-30 min、30-120 min、0-2 h及3-6h内显著降低(P<0.05)。2 miR-200b对肠上皮紧密连接的影响与NC组相比,NC+TNFα组TEER值降低(p<0.05)、FITC-dextran通透量显著增高(p<0.05)且MLCK和P-MLC表达上调(p<0.05)。与NC+TNFα组相比,200b+TNFα组TEER显著升高(p<0.05)、FITC-dextran通透量显著降低(p<0.05)、MLCK和P-MLC表达显著下调(p<0.05)。结论miR-200b降低TNFα诱导的肠上皮细胞趋化因子IL-8分泌,改善TNFα导致的肠上皮紧密连接损伤,具有保护肠上皮屏障的功能,其机制可能与miR-200b靶向调控C-JUN和MLCK相关。
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