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目的:糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)造成的严重和危害性较大的一种慢性并发症。其发病机制与慢性炎症有关,动物实验和DN临床患者的研究中均发现肾脏组织大量浸润的炎症细胞以巨噬细胞为主。其浸润程度与肾组织的损害程度趋势一致呈正相关。因此,巨噬细胞介导的炎症反应是加快DN发展的重要原因之一,TLR4是巨噬细胞表面的模式识别受体,其和配体的激活促进了巨噬细胞促炎因子(TNF-α、IL-1β等)的释放,加速了炎症反应的发生,促进了DN的发生发展。我们的前期研究也发现高糖状态下巨噬细胞表面TLR4表达增加,许多临床和实验也表明TLR4在高糖状态下表达增高,而其内源性配体HMGB1或者HSP60在糖尿病患者的血清中明显升高,两者在细胞表面的结合促进了巨噬细胞的活化,这种活化反复发生,促进了巨噬细胞促炎因子(TNF-α、IL-1β)的产生,而抑炎因子(IL-10)的产生减少或不足以调节DM状态下的平衡,长期作用导致了DN的发生。因此,选择一种免疫调节剂调节TLR4介导的炎症失衡可能是延缓DN发生的有效手段。黄芪是一种传统的中草药,主要发挥免疫调节作用,临床上黄芪已应用于DM及DN的治疗,但是,具体的作用机制还未完全明了。因此,本课题拟获得C57鼠的骨髓细胞,体外用中性粒-单核集落刺激因子(GM-CSF)进行刺激,诱导BMDM,分别以TLR4内源性配体HMGB1和外源性配体LPS刺激,再以不同浓度的黄芪进行干预,探讨黄芪是否能调节BMDM TLR4介导的炎症反应,进一步明确其调节机制。方法:1 BMDM的诱导 选择C57鼠,从髂骨获得骨髓细胞,将得到的细胞用1640培养液洗涤,然后将细胞铺到6孔板中,每孔中加入1ml的细胞与1640培养液的混合溶液,用50ng/ml的GM-CSF诱导72小时,取出6孔板,在电子显微镜下,观察细胞形态,每孔中加入1ml的1640培养液,再加入50ng/ml的GM-CSF诱导72小时,收集细胞备用。2 LPS、HMGB1和黄芪刺激BMDM细胞后炎症因子的产生 将诱导成功的BMDM以2×105个/孔浓度接种于12孔板,培养2h之后分别加入不同浓度的黄芪、LPS、HMGB1,作用24小时后,收集上清,ELISA检测IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10的表达。3黄芪对LPS、HMGB1刺激的BMDM细胞产生的炎症因子的影响 BMDM同上处理,首先加入LPS(1μg/ml)或HMGB1(200ng/ml),再加入不同浓度的黄芪,分别在作用4、12、24小时后,收集上清,ELISA检测IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10的表达。结果:1.LPS刺激BMDM细胞24小时后,上清中IL-6表达无明显变化,IL-1β、TNF-α、IL-10均是随着LPS浓度的增加而增高,呈浓度依赖性。2.HMGB1刺激BMDM细胞24小时后,上清中IL-1β、TNF-α的表达无明显变化,IL-6的表达随着HMGB1浓度的增加而增高,IL-10随着HMGB1浓度的增加而降低。3.黄芪刺激BMDM细胞24小时后,上清中IL-1β的表达各组间无明显变化;但均都低于对照组;TNF-α的表达均低于对照组,1mg/ml最为明显,随着黄芪浓度的增加又有所增高,但各组间无显著差异;IL-6的表达也有降低,随着黄芪浓度的增加降低明显,有浓度依赖性,在8mg/ml最为显著;IL-10的表达各组值均高于对照组,随着黄芪浓度增加而有所增高,只有在8mg/ml的浓度有显著差异。4.黄芪对HMGB1(200ng/ml)刺激BMDM时细胞炎症因子表达的调节作用:IL-1β:HMGB1单独刺激时,无明显变化,不同浓度黄芪组与其比较时,黄芪在2mg/ml时明显增高;TNF-α:HMGB1单独刺激时有下降趋势,但是变化不明显,在黄芪2mg/ml时降低明显,各组值均低于对照组;IL-6:HMGB1单独刺激时,表达量明显增高,在黄芪2、4、8mg/ml时增高明显,呈浓度依赖性,且各组值均高于对照组;IL-10:单独HMGB1刺激时,表达量明显降低,在黄芪1mg/ml时降低明显,但各组值随黄芪浓度增加而增高,且各组值均低于对照组。5.黄芪对LPS(1μg/ml)刺激BMDM细胞炎症因子表达的调节作用:IL-1β:LPS单独刺激时,24小时表达量明显增高,黄芪在2、4、8mg/ml的浓度时明显升高,呈浓度依赖性。TNF-α:LPS单独刺激时,在12h、24h各组浓度均增高,以12小时最高;黄芪作用后,各组浓度在12h无明显变化,在24h时4、8mg/ml与24h的LPS组相比有所下降。IL-6:LPS单独刺激时在4h最高,随时间延长呈下降趋势,黄芪1、8mg/ml浓度在此时明显降低其表达,在12h的1mg/ml浓度仍然是降低,但其他浓度无明显变化,24h时黄芪各浓度均降低,但各浓度间无显著差异。IL-10:LPS单独刺激时,在12h表达量最高,到24h时显著降低,黄芪2、4、8mg/ml刺激后12h时表达量均增高,以4mg/ml的浓度最为显著,24h黄芪各浓度均显著低于LPS组。结论:1.LPS刺激BMDM细胞产生TNF-α、IL-1β、IL-10,且呈浓度依赖性。2.HMGB1刺激BMDM时产生IL-6,而抑制IL-10的表达。3.黄芪抑制BMDM细胞的TNF-α、IL-6的表达,促进IL-10的表达。4.黄芪在低浓度时抑制HMGB1刺激BMDM细胞对TNF-α、IL-10的表达,促进IL-6、IL-1β的表达。5.黄芪抑制LPS刺激BMDM细胞产生TNF-α、IL-6,促进IL-10的表达。6.黄芪作为一种重要的免疫调节剂,对炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6都有不同程度的抑制作用,但对抑炎因子IL-10有促进作用,且可以抑制LPS、HMGB1介导的炎症反应,从而减缓巨噬细胞介导的炎症反应的发生发展,为DN的治疗提供了新的治疗依据。