论文部分内容阅读
黄曲霉毒素是曲霉属真菌（黄曲霉、寄生曲霉）产生的一组次生代谢产物。在目前所发现的黄曲霉毒素中,黄曲霉毒素B1（AFB1）是毒性最大,致癌性最强的一种。AFB1容易被生物体内的细胞色素P450氧化酶（Cytochrome P450,CYP）活化成中间产物AFB1-8,9-epoxide（AFBO）,AFBO极易与DNA结合造成基因毒性。鸡对AFB1十分敏感,已有报道CYP1A5参与鸡肝脏AFB1的代谢,但目前对于CYP1A5代谢AFB1的作用机制并不清楚。同时CYP1A4是CYP1A5的同源蛋白,二者序列一致性高达88%,但并不清楚CYP1A4代谢AFB1的活性。本研究首先对鸡CYP1A4、CYP1A5序列进行改造,使其蛋白序列的N端带17α信号肽,并在C端添加3个甘氨酸和His标签以利于纯化。利用pCWOri+载体在大肠杆菌DH5α中表达目的蛋白,通过络合有镍离子的琼脂糖亲和纯化获得重组鸡CYP1A4、1A5蛋白,SDS-PAGE鉴定其蛋白纯度超过95%。以人CYP1A2晶体结构（PDB ID:2HI4）为模板,通过SWISS-MODEL自动建模创建了鸡CYP1A5的结构模型。利用对接软件AutoDock 4.2将CYP1A5与AFB1进行分子对接。根据得到的对接模型,预测底物结合口袋处Thr-131、Phe-132、Phe-233、Phe-267、Asp-322 5个氨基酸残基可能与AFB1存在相互作用。对这些位点进行定点突变,表达纯化获得了CYP1A5 T131A、F132A、F132W、F132Y、F233A、F233W、F267A、F267W、D322A 9个突变体。通过Fe2+·CO还原光谱显示CYP1A4、CYP1A5及其突变体在450 nm处均有P450蛋白典型的吸收峰。同时圆二色光谱显示所有蛋白在208 nm和222 nm具有明显的负峰,表明是典型的以α-螺旋为主的二级结构。为比较蛋白对AFB1的代谢活性,将鸡CYP1A5及突变体与AFB1进行体外孵育,HPLC检测代谢产物峰面积,通过标准曲线转换为酶活性。实验结果证实鸡CYP1A4代谢AFB1能力弱,鸡CYP1A5代谢AFB1的Kcat值为0.29 min-1。鸡CYP1A5突变体F132A不具有代谢AFB1的活性。突变体F132W恢复代谢活性,几乎与野生型一致。突变体D322A、F267A、F233A的代谢活性明显降低,催化效率(Kcat/Km)仅为野生型的13%、17%、22%。突变体T131A催化效率(Kcat/Km)则为野生型的1.26倍。为了检验预测的氨基酸位点是否对底物AFB1具有专一性,本研究进一步检测了鸡CYP1A5及其突变体对CYP1A家族的模式底物7-乙氧基试卤灵的代谢活性。CYP1A4代谢7-乙氧基试卤灵的Kcat为0.45 min-1,CYP1A5的Kcat为0.04 min-1。鸡CYP1A5各突变体对7-乙氧基试卤灵的代谢情况与对AFB1的非常相似。F132A对7-乙氧基试卤灵同样无代谢活性。突变体F132W同样恢复代谢活性。突变体F267A、F233A、D322A的代谢活性降低,催化效率(Kcat/Km)分别降低了40%、50%、90%。突变体T131A催化效率(Kcat/Km)为野生型的2.7倍。根据CYP1A5与AFB1分子的对接模型,推测Phe-132、Phe-233、Phe-267可能与AFB1分子存在堆积作用;Asp-322的侧链与AFB1分子形成氢键稳定了AFB1在活性口袋的结合。同时可能由于7-乙氧基试卤灵与AFB1都是芳香杂环结构,以上氨基酸位点在代谢7-乙氧基试卤灵上起着同样的作用。综上所述,本研究通过蛋白质工程改造技术,确定了Phe-132是鸡CYP1A5代谢AFB1的关键氨基酸,同时Phe-233、Phe-267和Asp-322对于CYP1A5催化AFB1的活性同样发挥重要作用。Phe-132、Phe-233、Phe-267、Asp-322四个位点分别突变成丙氨酸,可有效地降低了CYP1A5对AFB1的酶活。