副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种革兰氏阴性短杆菌,是海产品引起食物中毒的重要致病茵之一,其致病性与其产生的毒力因子密切相关。细菌蛋白分泌系统及其表面蛋白可通过与宿主相互作用而直接参与病原茵的致病过程。VI型分泌系统(T6SS)是细菌重要的蛋白分泌系统,在细菌的生存和致病过程中起着至关重要的作用,目前国内外关于副溶血弧菌T6SS功能的报道还很少。已有报道表明烯醇化酶是细菌重要的黏附因子,参与多种病原的致病过程,至今还没有关于副溶血弧茵的烯醇化酶及其功能的报道。本研究首次研究了副溶血弧菌T6SS-1中主要核心组分VipA1, Hcp1舳DotU1,以及表面黏附因子烯醇化酶的生物学功能。1.副溶血弧茵主要毒力相关因子的分布了解副溶血弧菌毒力相关因子在分离株中分布情况,对于了解细菌的致病机制和潜在的致病因子至关重要。我们对实验室中155株副溶血弧菌环境分离株和30株临床分离株的溶血素基因(tdh和trh)、黏附相关因子基因(MAM7和eno)、Ⅲ型分泌系统(T3SS-1和T3SS-2)以及VI型分泌系统(T6SS-1和T6SS-2)基因簇中的主要基因进行PCR检测。结果显示：在所有临床分离株和环境分离株中MAM7和eno、T3SS-1和T6SS-2基因的检出率均为100%,提示这些因子可能与副溶血弧茵在环境中的生存密切相关。溶血素基因tdh和trh, T3SS-2和T6SS-1基因,在临床分离株中的检出率分别为93.3%、6.7%、83.3%和86.7%,在环境分离株中的检出率分别为2.5%、0.6%、1.3%和21.9%,结果表明tdh和trh, T3SS-2和T6SS-1在临床株中的分布率显著高于环境株,提示它们在副溶血弧菌的致病过程中起着重要的作用。2.副溶血弧茵T6SS-1中vipAl、hcpl和dotUl基因缺失株的构建利用同源重组技术成功构建了vipAl、hcpl和dotUl基因缺失株和互补株,均具有较好的遗传稳定性。荧光定量PCR和Western blot证实,缺失株中的相关基因均处于低转录水平和低表达水平。Western blot检测细菌培养上清和菌体沉淀中的Hcpl和Hcp2表达情况,结果表明：副溶血弧菌野生株SH112的沉淀和上清中均能检测到Hcp1和Hcp2蛋白,说明SH112具有功能性的T6SS-1和T6SS-2；在各缺失株的上清中均能检测到Hcp2蛋白,说明T6SS-1基因的缺失没有影响T6SS-2的功能；在vipA1、办cpl和dotUl基因缺失株的培养上清中,均不能检测到Hcp1,说明这三个基因均对副溶血弧菌T6SS-1分泌Hcp1的功能起着非常重要的作用。3.副溶血弧茵T6SS-1中vipA1、hcpl和dotU1基因缺失株特性分析通过比较副溶血弧菌SH112及其vipA1、hcp1和dotU1基因缺失株的生物特性,研究T6SS-1中三个主要基因对副溶血弧菌在环境适应性和致病性两方面功能的影响。结果表明,与野生株相比,三个基因缺失株在运动性和耐药性上与野生株没有显著差异。生长试验表明,与野生株相比,hcp1基因的缺失使细菌的生长变快。pH值影响试验表明,△hcp1抗酸应激能力变强,ΔvipA1变弱,ΔdotUl与野生株差异不显著。抗盐试验表明,Ahcp1抗盐应激能力变强,ΔvipA1和AdotUl与野生株差异不显著。生物被膜试验表明,与野生株相比,hcp1、vipA1和dotUl基因缺失株形成生物被膜的能力与野生株相比均显著下降。细胞黏附试验表明,vipAl、hcpl和dotUl这三个基因缺失均能使副溶血弧菌黏附HeLa细胞的能力显著下降,且影响水平相当。细胞毒性试验表明,vipA1、 hcpl和dotUl基因的缺失都能使副溶血弧菌及其培养上清对细胞的毒性下降,其中dotUl基因缺失株下降水平最显著。此外,通过Caspase活性检测表明vipAl、hcpl和dotUl基因缺失株均能引起细胞凋亡,证实T6SS-1与副溶血弧菌的细胞凋亡相关。细胞因子检测表明,与野生株相比,Δhcp1、AvipA1和ΔdotU1感染小鼠巨噬细胞引起促炎因子分泌能力显著降低。以上结果表明,副溶血弧菌T6SS-1基因簇中vipA1、hcpl和dotUl基因的缺失均影响了副溶血弧茵在抗酸应激、抗盐应激、生物被膜形成能力、细菌细胞黏附,细胞毒性和细胞因子分泌等生物特性。提示T6SS-1在副溶血弧菌的环境适应性和致病性上发挥重要的作用。4.副溶血弧茵vipAl和hcpl双基因缺失株的构建及特性分析在单基因缺失的基础上,进一步构建了vip1-hcp1双基因缺失株,并比较了野生株、单基因缺失株和双基因缺失株的生物特性。结果表明双基因缺失株在运动性和耐药性上,与野生株相比没有显著差异；在抗酸应激能力上与野生株相比,△hcp1能力变强,AvipA1变弱,AvipA1-hcp1;没有显著差异,提示双基因的缺失抵消了单基因缺失引起的细菌抗酸能力的不同变化；在抗盐应激上,ΔvipA 1-hcp1与野生株相比没有显著差异。vipAl和hcpl双基因的缺失进一步使细菌生物被膜形成能力下降。vipA1和hcpl双基因的缺失使副溶血细菌在细胞黏附能力、细胞毒性,细胞凋亡能力以及诱导促炎性因子的水平均进一步下降,且显著低于单基因缺失株。结果提示,vipAl和hcp1在副溶血弧菌环境适应性和致病性方面的功能具有协同作用,同时进一步证实T6SS-1在副溶血弧菌的环境适应性和致病性上发挥重要的作用。5.副溶血弧茵烯醇化酶克隆表达及生物学活性已有研究表明,烯醇化酶是一种多功能酶,除了参与细胞的代谢过程,还在很多病原的致病过程发挥重要作用。为确定烯醇化酶在副溶血性弧茵致病过程中的作用,对该酶进行了序列测定、表达及活性检测。序列分析表明,烯醇化酶开放阅读框为1302bp,编码约433个氨基酸,具有膜外功能区和跨膜区,但是不具有信号肽区。与其他弧茵的核苷酸同源性在85%-98%。原核表达并纯化烯醇化酶重组蛋白,SDS-PAGE结果表明目的蛋白约52kD,能够被感染副溶血弧茵的小鼠血清识别,表明其是一种细茵感染相关蛋白。纯化蛋白免疫兔制备多抗,ELISA结果表明效价可达到1：32,000,表明其具有较好的免疫原性,可以刺激机体产生抗体。酶活试验表明,纯化的重组蛋白具有催化2-磷酸-D-甘油酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的活性。本试验为进一步研究烯醇化酶的功能奠定基础。6.副溶血弧茵烯醇化酶生物学功能及免疫保护性研究通过蛋白定位、黏附和黏附抑制、免疫保护等试验进一步分析烯醇化酶在副溶血弧茵致病过程和免疫保护中的作用。Western blot、质谱法(LC-MS/MS)、胶体佥免疫电镜等试验结果表明,在副溶血性弧茵的培养上清、外膜、细胞质中均能检测到烯醇化酶,其分子量约48kD。ELISA测定表明烯醇化酶能够结合人纤维蛋白溶酶原,且具有浓度依赖性的特点。免疫荧光试验表明,重组烯醇化酶能够黏附Hep-2细胞；黏附抑制试验发现,烯醇化酶重组蛋白及其抗血清能够抑制副溶血弧茵黏附Hep-2细胞。免疫保护试验显示,重组烯醇化酶对的小鼠的相对保护率与灭活副溶血弧茵相当,均达到86.7%。以上试验提示,烯醇化酶可能是副溶血弧茵的一种重要的黏附因子,在该茵定殖过程中发挥重要作用,并且可作为抗副溶血性弧茵感染的一种新的疫苗候选抗原。