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结核病(tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)引起的一种人兽共患的慢性传染病,被列为世界上危害最严重疾病之一。结核分枝杆菌是一种兼性细胞内寄生菌,在感染宿主后,主要被机体的巨噬细胞所吞噬。结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)与宿主巨噬细胞已协同进化数千年,形成了一套非常复杂且精密的互作机制,能够逃避巨噬细胞的杀伤作用,而且大多数逃脱的MTB,会在巨噬细胞内长期潜伏下来。尽管目前已从整体、细胞、分子(蛋白质和基因)等不同水平开展了广泛研究,然而人们远未完全知晓其是通过何种手段有效逃避杀灭。高通量深度测序技术的发展,为病原菌与宿主之间的互作研究提供了一扇窗口,改变了人们对转录组学的思维方式,也给结核分枝杆菌与宿主巨噬细胞在转录组互作水平上的研究提供了准确且高效的方法。本研究是基于本实验室前期MTB/BCG感染THP-1细胞后信使RNA(mRNA)和非编码RNA(noncoding RNA)的RNA-seq高通量测序数据的研究基础,通过对巨噬细胞与结核分枝杆菌强弱毒株互作水平上转录组的生物信息学分析,根据宿主病原菌两个方面转录组的变化,确定了结核分枝杆菌与巨噬细胞互作中宿主RNA向细菌转移的事实。主要研究结果如下:1.RNA-seq高通量深度测序数据的生物信息学分析对MTB/BCG和THP-1细胞互作样品的高通量测序(RNA-seq)数据进行全面的基础分析。6个THP-1样品(在6h和24h MTB/BCG感染的THP-1细胞和对照THP-1细胞)中的表达基因达到了人类基因总数的76.43%;4个MTB样品(MTB感染THP-1细胞后6h和24h的胞内菌和胞外菌)中表达基因达到了 MTB基因总数的97.79%;4个BCG样品(BCG感染感染THP-1细胞后6h和24h的胞内菌和胞外菌)中表达的基因达到了 BCG基因总数的98.14%。以上分析说明基因检出在测序中已经达到了饱和,基因的表达情况都符合建库分析的要求。本研究统计了实验所产生的测序序列的定位个数及其占有效读数的百分比。将THP-1细胞测序样品的有效RNA-seq序列定位到人的参考基因组上,有84%～92%的总比对率。THP-1细胞的感染组和对照组相比,转录组整体变化不大;将胞内菌测序样品有效RNA-seq序列分别比对到结核分枝杆菌H37RV标准株和BCG的参考基因组上,只有6.25%-45.97%的总比对率,而其在人的参考基因组的总比对率反而达到了 49.29%-67.63%。通过对以上测序结果的全基因组定位分析显示,发现胞内菌RNA-seq的高通量测序样品中含有大量的THP-1细胞的RNA。为了排除以上发现是由于RNA提取时来自宿主源RNA的污染,对RNA-seq所用胞内菌的RNA样品进行了电泳分析,样品质量符合细菌RNA的质量特征。也对胞内菌内的细胞mRNA的分布进行了比较分析,胞内菌中的宿主mRNA分布特征与宿主细胞内的mRNA的分布特征不同,也说明了胞内菌中的宿主细胞的RNA不是来自分离时的污染。根据细胞和胞内菌之间表达量(RPKM)的差异共选择了 3类THP-1细胞的mRNA,第一类是在巨噬细胞内丰度高,在胞内菌中丰度较低的mRNA,共10个。第二类是在巨噬细胞内丰度低,在胞内菌中丰度较高的mRNA,共12个。第三类是在巨噬细胞内存在,在胞内菌中不存在的mRNA,共8个;这三类基因的共同存在,也能从侧面说明本研究所出现的现象不是由污染等因素造成的。2.绝对荧光定量PCR试验验证进入到胞内菌的宿主RNA对不同的THP-1细胞和胞内菌样品的RNA进行定量验证,根据THP-1细胞和胞内菌的丰度差异的验证,对结核分枝杆菌与巨噬细胞互作中RNA的交流现象进行判定。由于需要同时对THP-1细胞和胞内菌同时进行定量试验,本研究采用了绝对绝对荧光定量PCR的方法展开验证。通过重组质粒的方法共制做了 20个mRNA和14个miRNA的标准品。荧光定量的结果显示,宿主巨噬细胞转移到结核分枝杆菌的mRNA中,既有THP-1细胞的丰度比胞内菌高的mRNA,如IL1B、IL8和IER3等。也存在胞内菌的丰度比THP-1细胞低的mRNA,如DHFR、TANK和7SK等。miRNA的定量结果也类似,从宿主巨噬细胞转移到结核分枝杆菌的miRNA,胞内菌比THP-1细胞丰度低的miRNA有hsa-miR-142-3P和hsa-miR-30e-5p。胞内菌比THP-1细胞丰度高miRNA 有 hsa-miR-155-5p、hsa-miR-550a-3-5p、chrl-9929(novel miRNA)和chr19-9303(novel miRNA)。不论是mRNA还是miRNA都存在宿主巨噬细胞的RNA向胞内菌转移的现象。3.反转录PCR检测没有进入到胞内菌的宿主RNA通过对RNA-seq数据的筛选,选出了一些在THP-1细胞内有一定表达丰度,而在胞内菌中不存在的mRNA,进行反转录PCR验证,结果显示MTB或BCG刺激后的THP-1细胞样品能检出清晰的条带,而相对应胞内菌样品所对应的样品没有条带。这从侧面说明宿主巨噬细胞的RNA进入到MTB/BCG具有一定的选择性,并非由污染等随机因素所造成的。4.原位杂交试验验证进入到胞内菌的宿主RNA本试验旨在对巨噬细胞进入到胞内菌的mRNA进行直接定位,选取了从巨噬细胞进入到胞内菌的丰度较高的4个mRNA,并通过体外转录的方法,合成了地高辛标记的RNA探针。通过用1Ong/μL探针对THP-1细胞和胞内菌样品进行杂交,从而达到对RNA直接定位的目的。原位杂交的结果显示,7SK、DHFR、IL1B和IL8探针能够在THP-1细胞的胞核和胞质区域定位到明显的荧光信号,同时也能在胞内菌样品中也能定位到相应荧光信号。原位杂交与荧光定量PCR的试验结果相一致,这将为宿主巨噬细胞的RNA转移到胞内菌的现象提供强有力的证据。通过对结核分枝杆菌与宿主巨噬细胞互作样品的高通量深度测序数据的生物信息学分析、绝对荧光定量PCR试验、反转录PCR以及原位杂交等试验的验证,证实了结核分枝杆菌与巨噬细胞互作中,存在巨噬细胞的RNA选择性地转移到MTB/BCG的现象,这种现象可能与细胞的抗感染机制有关。