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半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是我国北方重要的海产经济鱼类之一,它味道鲜美,适应性强,雌性生长速度是雄性的2-3倍,因此了解半滑舌鳎的性腺分化与发生,攻克性别决定机制对单性育种、提高育种质量等意义重大。目前,半滑舌鳎性别决定机制尚不十分清楚,且没有发现决定其性别分化的决定基因。因此对半滑舌鳎性别决定相关基因进行功能分析显得非常紧迫,可以为人工控制半滑舌鳎性别提供基础资料。本研究根据半滑舌鳎全基因组测序获得的部分序列,通过中间序列验证及RACE末端扩增,得到半滑舌鳎HH信号通路csshh、csdhh、csptchl x1、csptchl x2、cssmo等5个基因的cDNA全长；通过RT-PCR分析了csshh、csdhh、csptchl x1、csptchl x2、cssmo、csglil等6个基因在早期胚胎发育、雌雄成体不同组织、雌雄性腺发育不同期的表达；检测了csshh、csdhh、csptchl x1等3个基因启动子区的甲基化程度；通过FISH定位分析了csptchl x1与csptchl x2在染色体中的位置；通过ISH定位分析了csdhh、csptchl x1及csptchl x2在雌雄性腺中的表达；构建了csshh、csptchl x1与csptchl x2的原核表达载体及csshh与csdhh的真核表达载体。主要研究结果如下：1.克隆得到半滑舌鳎HH信号通路的5种基因,分别将其命名为csshh、csdhh、 csptchl x1、csptchl x2、cssmo。序列结构分析结果显示:csshh基因全长1922 bp,其中5’UTR 266bp,3’UTR 360bp, ORF 1296 bp,编码432氨基酸,经预测该多肽的相对分子质量为47.28 kDa,理论等电点6.95. csdhh基因全长2473 bp,其中5’UTR 475 bp,3’UTR 612 bp, ORF 1386 bp,编码432氨基酸,经预测该多肽的相对分子质量为51.38 kDa,理论等电点8.17。csptchl x1基因全长5212 bp,其中5’-UTR 298 bp,3’-UTR 282 bp, ORF 4269 bp,编码1543氨基酸,生物序列分析显示编码区有12次跨膜蛋白,有固醇敏感多肽区(sterol-sensing domain,SSD,并且信号肽区没有酶切位点。软件预测成熟csptchl x1的蛋白为171.5 KDa,等电点是6.29,同时氨基酸序列有很多的修饰位点。csptchl x2基因和csptchl x1高度同源,全长5773 bp,5’UTR 66 bp,3’UTR 769 bp, ORF 4638 bp,编码1545个氨基酸,结构预测有csptchl x1基因特征的12个跨膜区及SSD区。cssmo cDNA序列2535 bp,其中5’UTR 98 bp,3’UTR 232bp, ORF 2205 bp,推测ORF区编码736个氨基酸残基,蛋白分子大小为83.14 kDa,等电点为8.35。2.在胚胎期的相对定量结果显示：半滑舌鳎HH信号通路6种基因的表达量从囊胚期开始上升,在表达上均呈现先上升再下降的趋势。csdhh基因、cssmo基因与csgli 1基因在神经胚期的表达量最高,显著高于其它时期,而csshh基因、csptchl x1基因及csptchl x2的相对高表达分别出现在囊胚期、体节期以及胚孔关闭时期,均处于细胞分化的关键时期,这说明HH信号通路在胚胎的分化及组织器官的形成中发挥重要作用。3.在雌雄成鱼8个组织的定量结果显示：HH信号通路在脾、肝、脑、肾、肠、皮、心、性腺等8种组织中都有一定表达,与各组织的发生过程都密切相关。其中csdhh与csptchl x1、cssmo及csglil基因共同的表达特征是在雄性精巢高表达,因此推测csdhh-csptchl x1-cssmo-csglil信号通路对精巢的发生至关重要。csshh基因与csptchl x2基因在肝及脑中高表达,在雌性性腺的表达高于雄性,二者表达模式类似,因此我们推测跨膜蛋白csptchl x2基因是膜外csshh的受体,处于统一信号轴上,并且对多种组织器官的发生产生重要作用,尤其是雌性腺的发育。4.不同发育时期的性腺表达分析显示：csdhh 基因在雄鱼仔鱼出膜后35-65d微量表达,从80d起呈现上升趋势,在出膜后150d达到最高值,在1龄和2龄时有所下降,并且从95d起,精巢中的表达量始终显著高于卵巢,说明csdhh基因在性腺分化和精巢功能发挥上起重要作用。csdhh与csptchl x1、cssmo及csgli 1基因均在雄性性腺分化的关键时期95d较前期显著升高,且在雄性及伪雄1龄时的精巢表达显著高于卵巢中的表达,进一步说明csdhh-csptchl xl-cssmo-csglil信号通路对精巢的发生至关重要。分析csshh基因的表达发现,在仔鱼发育50-65d雌性性腺分化起始阶段,雌性性腺中csshh基因的相对表达量高于雄性个体,而在仔鱼发育80-95d既雄性性腺分化起始阶段,雄性性腺中csshh基因的相对表达量高于雌性个体,csshh基因在8月龄、1龄及2龄雌、雄及伪雄性腺中的表达,发现各时期卵巢的表达显著高于雄鱼及伪雄鱼精巢中的表达,因此推测csshh基因和性腺组织分化及卵巢发育有一定关系。csptch1 x2在雌性性腺特异表达,且在性腺分化的关键时期50天显著上升,在仔鱼发育65-80d时低表达,和csshh基因的表达模式类似,由此推测csptchl x2可能是csshh基因信号通路调控过程中的膜上受体,在性腺分化及雌性性腺发育中起重要作用。5.性腺组织csdhh、csshh、csptchl x1等3个基因启动子区的甲基化程度结果显示：其甲基化程度和该基因的表达正相关,既甲基化程度高抑制该基因的表达。6.组织原位杂交结果显示,csdhh和csptchl x1杂交信号主要在1龄精巢的初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞及支持细胞中表达,而在卵巢中的表达极其微弱。csptchl x2在半滑舌鳎雌雄均有表达。在半滑舌鳎雌性性腺中,定位于原始生殖细胞、卵原细胞、卵母细胞和滤泡细胞；在雄性性腺定位表达于精原细胞、支持细胞、精母细胞、精子细胞和精子,且卵巢中表达量高于精巢,且1龄雌雄性腺中的表达高于8月龄的表达,进一步直观说明HH信号通路在生殖细胞发育方面起重要作用。7.染色定定位结果显示：csptchl x1与csptchl x2定位于常染色体而非性染色体上。8.真核及原核表达载体的构建为后续深入进行功能研究奠定基础。