论文部分内容阅读
[背景]近年来肺移植有了飞速的发展,单肺移植、双肺移植及心肺联合移植均取得成功,成为挽救终末期肺疾病的有效手段,但是供肺的短缺仍然是阻碍肺移植发展的主要屏障。在多器官捐赠者中只有15%-25%的供肺适合肺移植,肾脏和肝脏的供体相对丰富,因此在所有实体器官移植中肺移植仍然是最少的[1,2]。安全有效的供肺保存方式可以改善供肺质量,提高肺移植成功率,缓解供肺紧缺。目前临床上公认的供肺保存方式是单次肺循环灌注后的低温浸润保存,保存时间为4h。虽然在肺离体初期进行了肺循环灌注,但在肺循环灌注完成后,仅予低温保存,限制肺组织获取能量,缩短供肺保存时限,阻碍供肺的远距离运输。体外肺灌注(exvivo lung perfusion,EVLP)一直以来都是肺移植技术研究的重点,尽管国内外许多研究从顺行灌注、逆行灌注、低温灌注、常温灌注、缺血预处理和支气管动脉再通技术等多个方面进行研究,但是对于离体肺损伤的机制及提高离体肺的安全时限仍未取得突破性进展,缺乏一种安全有效便捷的保护策略,现有肺保护方式日益突显出其局限性和面临的问题。[目的]本研究通过比较体外循环机持续灌注、间断压力灌注、单纯低温保存这三种犬离体肺保存方式对离体肺的影响,探讨离体肺损伤机制,探索最佳的离体肺保存方式。[方法]1.将30只Mongrel犬随机分成体外循环组、压力灌注组和低温保存组,每组10只。在保持机械通气的条件下,完整摘取双肺,离体肺连接体外循环机持续灌注、连接压力灌注系统间断灌注、单次灌注离体肺循环后4℃低温浸泡保存,并按时间点留取标本。2.持续监测并记录犬肺离体后每小时的血流动力学和血气分析指标。测定肺组织湿干比来比较肺组织水肿程度。3.采用抗坏血酸法测定总磷脂的含量,薄层色谱分析测定二棕榈酸磷脂酰胆碱含量,蛋白质印迹法测定肺组织中SP-B蛋白和SP-C蛋白,SYBR Green荧光实时定量PCR检测肺组织中SP-B mRNA和SP-C mRNA。4.采用流式细胞仪检测支气管肺泡灌洗液中中性粒细胞凋亡,免疫组织化学法检测犬离体肺肺泡巨噬细胞对凋亡中性粒细胞吞噬,BCA法测定肺组织总蛋白浓度,酶联免疫吸附试验检测白介素(IL-1a/2/6/8)。[结果]1.三种不同肺保存方式下离体肺肺功能的变化(1)进行体外肺灌注8h,各实验组中离体犬肺的肺功能指标呈现不同程度下降趋势,主要表现为氧合功能(P02/Fi02)、葡萄糖浓度逐渐下降,PC02、乳酸浓度、离体肺湿干比(W/D)逐渐升高。(2)体外循环组和间断压力灌注组中离体犬肺肺功能优于单纯低温保存组,主要表现为氧合功能(P02/Fi02)、葡萄糖水平明显高于低温保存组,两组中PC02、乳酸水平及肺组织W/D较低温保存组低。(3)体外循环组中离体犬肺肺功能优于间断压力灌注组,主要表现为肺动态顺应性、氧合功能(P02/FiO2)、葡萄糖水平明显高于间断压力灌注组,而肺血管阻力、PC02、W/D及乳酸水平低于间断压力灌注组。2.三种不同肺保存方式下肺表面活性物质的表达(1)二棕榈酸磷脂酰胆碱/总磷脂(DPPC/PL)的表达各实验组离体肺支气管肺泡灌洗液中二棕榈酸磷脂酰胆碱/总磷脂(DPPC/PL)的比值呈时间依赖性下降(P<0.05)。在1h～8h各时间点上,体外循环组中DPPC/PLL比值明显高于压力灌注组和低温保存组(P<0.05),压力灌注组中DPPC/PLL比值较低温保存组高(P<0.05)。(2)SP-B蛋白mRNA和SP-C蛋白mRNA的表达①SP-B蛋白mRNA的表达:体外循环组在Oh～2h和7h～8h SP-B蛋白mRNA的表达无明显变化(P>0.05),在1h～7h SP-B蛋白mRNA的表达明显减少(P<0.05);压力灌注组在Oh～2h、6h～7h和7h～8h SP-B蛋白mRNA的表达无明显变化(P>0.05),1h～6hSP-B蛋白mRNA的表达明显减少(P<0.05)。低温保存组在6h～7h SP-B蛋白mRNA的表达无明显变化(P>0.05),在1h～6h和7h～8h SP-B蛋白mRNA的表达明显减少(P<0.05)。在1h～8h各时间点上,体外循环组中SP-B蛋白mRNA的表达均明显高于低温保存组(P<0.05);在2h、3h、5h、6h和8h时间点上,体外循环组中SP-B蛋白mRNA的表达均明显高于压力灌注组(P<0.05);在3h～6h时间点上,压力灌注组中SP-B蛋白mRNA的表达均明显高于低温保存组(P<0.05)。②SP-C蛋白mRNA的表达:低温保存组和压力灌注组在1h～8h SP-C蛋白mRNA的表达随着时间的推移呈进行性下降(P<0.05);体外循环组在1h～7h SP-C蛋白mRNA的表达明显减少(P<0.05),在7h～8h SP-C蛋白mRNA的表达无明显减少(P>0.05)。在3h～8h时间点上,体外循环组中SP-C蛋白mRNA的表达均明显高于低温保存组(P<0.05);在3h、5h、6h和8h时间点上,体外循环组中SP-C蛋白mRNA的表达均明显高于压力灌注组(P<0.05);在4h、5h、7h和8h时间点上,压力灌注组中SP-C蛋白mRNA的表达均明显高于低温保存组(P<0.05)。(3)SP-B蛋白和SP-C蛋白的表达①SP-B蛋白的表达:各实验组内1h～3h SP-B蛋白表达无显著差异(P>0.05),4h～8hSP-B蛋白的表达量显著下降(P<0.05)。在1h～8h各时间点上,体外循环组中SP-B蛋白的表达均明显高于低温保存组(P<0.05);在1h～2h和4h～8h各时间点上,体外循环组中SP-B蛋白的表达均明显高于压力灌注组(P<0.05);4h～8h各时间点上,压力灌注组中SP-B蛋白的表达均明显高于低温保存组(P<0.05)。②SP-C蛋白的表达:体外循环组和压力灌注组在Oh～8h SP-C蛋白的表达呈下降趋势(P<0.05);低温保存组在1h～2h SP-C蛋白的表达无显著差异(P>0.05),3h～8hSP-C蛋白的表达明显减少(P<0.05)。在1h～8h各时间点上,体外循环组中SP-C蛋白的表达均明显高于低温保存组(P<0.05);在3h和5h～8h各时间点上,体外循环组中SP-C蛋白的表达均明显高于压力灌注组(P<0.05);在1h和3h～8h各时间点上,压力灌注组中SP-C蛋白的表达均明显高于低温保存组(P<0.05)。3.三种不同肺保存方式下炎症反应指标的表达(1)随着犬肺离体时间的推移,各实验组离体肺支气管肺泡灌洗液中凋亡的中性粒细胞明显减少,各实验组在1h～3h中性粒细胞凋亡变化不显著(P>0.05),在4h～8h凋亡的中性粒细胞明显减少(P<0.05);在1h～3h各时间点各实验组间凋亡的中性粒细胞无显著差异(P>0.05),4h时体外循环组和压力灌注组中凋亡的中性粒细胞较低温保存组中显著增加(P<0.05),在5h～8h各时间点各实验组间凋亡的中性粒细胞数有显著差异(P<0.05),体外循环组中凋亡的中性粒细胞数最多,压力灌注组中次之,低温保存组中最少。(2)各实验组吞噬凋亡中性粒细胞的巨噬细胞随着离体时间的延长呈逐渐减少的趋势(P<0.05);在肺离体后各时间点上,体外循环组中巨噬细胞对凋亡中性粒细胞的吞噬清除优于间断压力灌注组和单纯低温保存组(P<0.05),在1h、2h时间点上,间断压力灌注组中和单纯低温保存组中巨噬细胞对凋亡中性粒细胞的吞噬清除无明显差异(P>0.05),在3h～8h时间点上,间断压力灌注组中巨噬细胞对凋亡中性粒细胞的吞噬清除优于单纯低温保存组(P<0.05)。(3)各实验组在各时间点上中性粒细胞的凋亡和吞噬凋亡中性粒细胞的肺泡巨噬细胞的之间均呈明显的正相关(r=0.98,P<0.01;r=0.988,P<0.01;r=0.964,P<0.01)。(4)各实验组中IL-1a、IL-2、IL-6和IL-8的表达随着离体时间的延长呈时间依赖性升高(P<0.05);在肺离体后的大多时间点上,体外循环灌注组中IL-1a、IL-2、IL-6和IL-8的表达最低,间断压力灌注组次之,单纯低温保存组最高。[结论]采用体外循环机持续灌注保存方式使犬离体肺保存的安全时限延长至6～8h,其对犬离体肺的保护作用优于间断压力灌注保存和单次肺灌注后低温保存,间断压力灌注保存的肺保护作用又优于单次肺灌注后低温保存。