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鼻咽癌是以高转移性为突出特点的恶性肿瘤,大部分患者由于早期发生转移而预后不良。EB病毒(Epstein-Barr Virus, EBV)编码的主要致瘤蛋白即潜伏膜蛋白1 (latent membrane protein, LMP1)与鼻咽癌的发生和转移密切相关。趋化因子影响肿瘤细胞的黏附、侵袭和转移,趋化因子及其受体参与肿瘤转移的机制尚未完全阐明。趋化因子SDF-1 (CXCL12)受体CXCR4表达和活化可促进肿瘤细胞向高表达SDF-1的部位(如骨和淋巴结)转移,与多种肿瘤的生长和转移相关。最近几年,酪氨酸的硫酸化(tyrosine sulfation)作为一种重要的翻译后修饰(post-translational modification, PTM)的方式,因其对趋化因子受体活性调节而受到重视。酪氨酸的硫酸化的主要作用是促进分泌型蛋白的分泌或膜蛋白与其它蛋白特别是配体之间的相互作用。趋化因子受体CXCR4第21位的酪氨酸是其主要的硫酸化位点。体内负责催化酪氨酸硫酸化的酶为酪氨酰蛋白硫酸转移酶(tyrosylprotein sulfotransferase, TPST),编码该酶两种亚基的基因即TPST-1和TPST-2,都具有高度保守的硫酸转移酶区域,定位于高尔基体中的TPST-1可对酪氨酸进行硫酸化,参与酪氨酸的硫酸化循环。我们前期工作发现,LMP1在鼻咽癌细胞中通过NF-κB信号通路上调EGFR的表达并使其发生磷酸化；作为一个新型的转录因子,磷酸化的EGFR转位入核可反式活化与细胞增殖有关的基因如cyclinD1和cyclinE。同时,我们通过生物信息学发现TPST-1基因(GenBank AF038009)5’UTR内存在一个可能的EGFR结合位点,即TGTTT(位于-28—-24位之间)。这一发现使我们有理由推测EGFR可能通过该酶催化CXCR4硫酸化从而影响其与配体的结合。因此,我们提出LMP1可能通过EGFR调节CXCR4的活性促进鼻咽癌细胞的转移。1. CXCR4硫酸化促进鼻咽癌细胞的转移酪氨酸的硫酸化作为一种重要的翻译后修饰的方式,其在趋化因子受体活性调节中发挥重要的作用。利用高转移的5-8F和不转移的6-10B鼻咽癌细胞为基本模型,研究发现高转移的5-8F细胞呈高硫酸化状态。提示,硫酸化可能与细胞的转移能力有关。进一步利用硫酸化特异性抑制剂氯酸钠(sodium chlorate)抑制高转移的5-8F细胞蛋白硫酸化活性,通过趋化实验(chemotaxis)和Matrigel侵袭实验发现抑制5-8F细胞硫酸化可以抑制细胞的趋化活性和侵袭转移能力。同时利用不转移鼻咽癌6-10B细胞,转染野生型WT-CXCR4和突变型MUT-CXCR4表达质粒后,进行趋化实验和Matrigel侵袭实验,发现转染WT-CXCR4表达质粒后细胞的趋化活性和侵袭转移能力明显增强,而转染MUT-CXCR4表达质粒后并没影响细胞的趋化活性和侵袭转移能力。这些结果提示,细胞蛋白的硫酸化,特别是CXCR4的硫酸化与细胞的转移相关,而CXCR4第21位酪氨酸硫酸化在促进鼻咽癌细胞转移的过程中起到非常重要的作用。我们检测高转移5-8F细胞和不转移6-10B细胞的TPST-1的表达发现,高转移5-8F细胞TPST-1的mRNA水平和蛋白水平均高于6-10B细胞。进一步抑制5-8F的TPST-1可以抑制其CXCR4的硫酸化水平,而在6-10B细胞中转染TPST-1表达质粒可以上调CXCR4的硫酸化水平。近年来,在人们发现细胞表面的膜受体EGFR和FGFR能够移位入核之后,新近有研究发现细胞膜表面受体CXCR4同样能够入核。我们首先检测高转移和不转移的5-8F细胞和6-10B细胞的CXCR4是否存在核定位,采用亚细胞组分结合Western Blot及激光共聚焦技术,从定性和定量水平均发现5-8F细胞核内存在CXCR4蛋白的表达。进一步利用特异性硫酸化抑制剂和TPST-1 siRNA处理5-8F细胞后,SDF-1α30nm刺激细胞30min,发现其细胞核内的CXCR4蛋白明显减少。提示,CXCR4的核移位与CXCR4的硫酸化密切相关。2.EB病毒LMP1通过调节CXCR4功能活性促进鼻咽癌细胞转移上一个部分我们在5-8F和6-10B细胞中研究发现CXCR4的硫酸化与鼻咽癌细胞的转移密切相关。我们实验室前期研究发现LMP1在高转移5-8F细胞的表达高于不转移6-10B细胞,结合LMP1在鼻咽癌细胞侵袭和转移过程中发挥重要作用,提示我们：在鼻咽癌细胞中,LMP1可能是通过对CXCR4硫酸化的调控,进而影响鼻咽癌的转移。首先应用流式细胞术进一步确证高硫酸化的5-8F细胞高表达LMP1后,采用可调控LMP1表达的细胞系,本研究发现在鼻咽癌细胞系中LMP1可诱导CXCR4的表达,并呈剂量诱导效应。进一步采用免疫共沉淀将CXCR4沉淀分离后,Western Blot检测酪氨酸硫酸化水平即CXCR4硫酸化变化。结果发现,随DOX剂量的增加,CXCR4的硫酸化也随之增加。提示,LMP1能够上调CXCR4的硫酸化。同样我们应用Tet-on LMP1 HNE2细胞,用不同DOX剂量诱导24h后,在不同浓度的SDF-1α的作用下,进行趋化实验,结果发现LMP1能够上调CXCR4的趋化活性,说明LMP1通过上调CXCR4硫酸化进而影响其功能活性。业已证实LMP1调控CXCR4的硫酸化及其功能活性,那么我们将探讨LMP1是否诱导CXCR4核移位。采用亚细胞组分结合Western Blot及激光共聚焦技术,我们从定性和定量水平均发现Tet-on LMP1HNE2细胞核内部分存在CXCR4的蛋白表达,且随LMP1表达的增加而增加。进一步我们在Tet-on LMP1 HNE2细胞中转染WT-CXCR4和MUT-CXCR4表达质粒24h后,分别在DOX (0,6ug/ml)剂量诱导下,采用亚细胞组分结合激光共聚焦技术,我们从定性水平发现LMP1促进了WT-CXCR4组细胞CXCR4蛋白的核积聚。这些结果表明LMP1通过调控CXCR4的硫酸化进而影响CXCR4的核移位。最后利用HNE2-PSG5和HNE2-LMP1细胞,分别转染WT-CXCR4和MUT-CXCR4表达质粒24h后,Matrigel侵袭实验发现LMP1促进转染WT-CXCR4质粒组细胞的侵袭转移能力,并没有影响MUT-CXCR4质粒组细胞侵袭转移能力。进一步说明LMP1通过诱导CXCR4第21位酪氨酸硫酸化功能活性进而促进鼻咽癌细胞的转移。3.EB病毒LMP1通过EGFR介导CXCR4硫酸化我们的前期工作证实LMP1上调转录因子EGFR的表达,而且我们通过基因信息学发现酪氨酰蛋白硫酸转移酶TPST-1的启动子区存在EGFR的结合位点。因此我们推测LMP1有可能是通过EGFR介导TPST-1上调CXCR4的硫酸化。采用鼻咽癌Tet-on LMP1 HNE2细胞,应用Real-time-PCR和Western Blot技术发现LMP1上调TPST-1的mRNA和蛋白水平,EGFR siRNA处理Tet-on LMP1 HNE2细胞24h阻断EGFR表达后,TPST-1表达下调,初步说明LMP1诱导的TPST-1是EGFR所依赖的。采用ChIP发现,LMP1可以促进EGFR与TPST-1的结合,采用报告基因分析发现,LMP1增加TPST-1启动子活性,而突变EGFR与TPST-1的结合位点,我们发现LMP1增加的TPST-1启动子活性显著下调。进一步说明LMP1诱导的TPST-1和CXCR4的硫酸化是EGFR所依赖的。小结：我们以鼻咽癌细胞系为基本实验模型,从比较具有不同转移潜能的鼻咽癌细胞系之间CXCR4硫酸化状态的差异入手,进行LMP1对CXCR4硫酸化及亚细胞定位和功能的研究,本研究主要采用阻断策略结合Western Blotting、趋化实验、侵袭实验、ChIP、体外定点突变等分子生物学实验方法,从蛋白硫酸化修饰的角度来阐明LMP1调节CXCR4的分子机制,取得如下重要的创新性发现：1.首次发现CXCR4的硫酸化可以促进鼻咽癌细胞的转移。抑制高转移5-8F细胞的硫酸化可以抑制其CXCR4的趋化活性和细胞的侵袭转移能力,且转染野生型的CXCR4表达质粒可以促进不转移的6-10B细胞CXCR4的趋化活性和细胞侵袭转移能力。高转移鼻咽癌细胞高表达硫酸化转移酶TPST-1,且TPST-1siRNA可以有效的阻断CXCR4的硫酸化。首次发现鼻咽癌5-8F细胞核内存在CXCR4蛋白的表达。利用特异性硫酸化抑制剂和TPST-1siRNA抑制CXCR4的硫酸化可有效阻断5-8F细胞CXCR4蛋白核移位。2.首次发现EB病毒LMP1上调CXCR4的硫酸化水平、功能活性和促进CXCR4蛋白的核移位,并呈一定剂量效应。且发现LMP1调控CXCR4核移位是通过其上调CXCR4的硫酸化实现的。同时发现LMP1上调CXCR4的硫酸化与鼻咽癌细胞转移相关。3.首次发现LMP1可以上调TPST-1的mRNA和蛋白表达水平,并呈剂量依赖效应。EGFR siRNA可以抑制LMP1上调的TPST-1表达。在LMP1调控下,转录因子EGFR与TPST-1的启动子结合增强。并发现LMP1增加TPST-1启动子活性,突变EGFR在TPST-1启动子上的结合位点可以下调LMP1调控的TPST-1的启动子活性。本论文以EBV的致瘤蛋白LMP1通过转录因子EGFR对酪氨酸硫酸化转移酶TPST-1的调控为切入点,从CXCR4硫酸化翻译后修饰的角度来阐明LMP1-EGFR-TPST-1-CXCR4信号转导通路在鼻咽癌转移中的分子机制及其生物学意义。通过本研究,将EB病毒与趋化因子及其受体通过信号转导联系起来,提出了新的工作模式。为EB病毒致瘤分子机理研究开拓一个新的视野,为靶向LMP1和CXCR4抗信号转导治疗肿瘤提供了新的实验依据,这将有助于从分子水平揭示鼻咽癌转移发生机制,为鼻咽癌的防治提供新的理论依据。