氨基酸作为重要的神经递质,对大脑正常的生理活动有调节作用,谷氨酸( Glu)是中枢神经系统内最主要的兴奋性神经递质。在神经系统的一些病变中均涉及到了谷氨酸的过度释放,继而通过激活其受体——NMDA受体,介导兴奋性损伤作用,破坏脑神经元。脑缺血缺氧时,神经元释放的谷氨酸是引起神经元死亡的重要原因。由于大脑本身不能储存能量,缺血缺氧使得脑内能量代谢障碍,ATP供应不足,导致GLU的释放增加;Na+,K+-ATP酶活性降低,细胞内水钠储留,细胞内Na+浓度升高,Na+-Ca2+发生逆相转运,引起Ca2+超载,受Ca2+调节的磷脂酶、蛋白酶、核酸内切酶等被激活,导致膜磷脂分解和细胞骨架破坏,细胞产生不可逆性损伤。Na+,K+-ATP酶属于P型ATP酶超家族的一员,具有多种调节功能,包括:维持细胞内外Na+、K+的稳态,维持膜的兴奋性,还参与组合多种蛋白复合物并向细胞内传递多种信号。作为维持细胞基本生理功能的关键酶,Na+,K+-ATP酶在缺氧中所发挥的作用越来越受到重视。缺氧发生时,ATP的合成发生障碍,抑制了Na+,K+-ATP酶的离子泵功能,细胞内钠离子浓度升高,进一步通过钠钙交换,导致细胞内钙超载,从而导致脑水肿。我们的前期研究也已证明,缺血缺氧后,脑组织不仅兴奋性氨基酸释放增多[1],而且Na+,K+-ATP酶活性明显降低,其高亲合力α2亚基和α3亚基,无论在mRNA水平还是蛋白水平均明显降低,而α1亚基则无明显改变[2],提示Na+,K+-ATP酶高亲合力α亚基参与了脑缺血缺氧性损伤。由于缺血缺氧损害时,既存在Na+,K+-ATP酶功能的抑制,同时又存在兴奋性氨基酸的释放和NMDA受体的过度激活。两者之间是否存在某种关联?为了更清晰地揭示神经系统缺血缺氧损害的发生机制,我们观察了缺氧对大鼠皮层神经元氨基酸电流(主要是NMDA电流)的影响,并进一步探讨了缺氧条件下Na+,K+-ATP酶是否参与神经元缺氧损伤所致的NMDA受体过度激活。目的:观察缺氧前后,Na+,K+-ATP酶是否参与神经元兴奋性氨基酸电流的改变及其发生机制。方法:取出生12-16天的SD乳大鼠,按常规方法制备脑片,在灌流正常或者无氧低糖的人工脑脊液(ACSF)的情况下,利用带有红外微分干涉相差显微镜的脑片膜片钳系统,以全细胞whole-cell模式记录皮层神经元的NMDA受体电流,分别观察缺氧、AP-5或MK-801、以及不同浓度的双氢哇巴因(Dihydroouabain,DHO)对NMDA电流的影响。结果:1皮层神经元NMDA电流鉴定在本实验条件下记录的NMDA电流为一个内向移动电流,在灌流NMDA受体的特异性阻断剂AP-5或MK-801后,此电流的内向移动可被阻断。其中AP-5对NMDA电流的抑制率为94.95%,MK-801对NMDA的抑制率为89.17%,表明所记录到的内向电流确为NMDA电流。2皮层神经元NMDA电流稳定性研究皮层神经元在20分钟内,重复给与相同浓度的NMDA,所引起的NMDA电流大小基本相等,提示大鼠皮层神经元对NMDA的反应稳定。因此我们大部分实验均在20分钟以内完成,以保证实验结果的可靠性。3缺氧对皮层神经元NMDA电流的影响在常氧情况下,分别以10μmol/L、50μmol/L和80μmol/L的NMDA灌流神经元,均能产生一个内向的NMDA电流,其电流密度分别为3.557±0.393pA/pF、6.987±0.509pA/pF和7.226±0.558 pA/pF。而经缺氧处理后,神经元的NMDA电流密度分别增大到4.026±0.546pA/pF、8.558±0.775pA/pF和10.066±1.242 pA/pF。这些结果表明,缺氧可使皮层神经元NMDA电流显著增大,且增大幅度具有明显的NMDA浓度依赖性。另外,我们发现当用缺氧外液灌流皮层神经元5min后,其膜电流可出现一个内向移动,且此移动可被Ap-5(100μmol/L)或Mk-801(100μmol/L)所抑制。其中AP-5可使缺氧所致皮层神经元内向移动电流密度由0.272±0.144pA/pF减少到0.019±0.007pA/pF,抑制率是91.26%; MK-801可使缺氧所致皮层神经元内向移动电流密度由0.252±0.097pA/pF减少到0.025±0.012pA/pF,抑制率是90.13%。而且,在用生理浓度(1μmol/L)NMDA预先灌流神经元的情况下,再进行缺氧处理可使此种膜电流的内向移动进一步加大,其电流密度可由0.211±0.079pA/pF显著增加到0.555±0.195pA/pF。且此电流变化可被Ap-5(100μmol/L)或Mk-801(100μmol/L)所抑制,Ap-5(100μmol/L)可使其由0.543±0.32pA/pF减小到0.031±0.039pA/pF,抑制率是92.10%;Mk-801(100μmol/L)可使其由0.62±0.079 pA/pF减小到0.056±0.009 pA/pF,抑制率是90.84%。上述这些结果不仅表明缺氧在皮层神经元引起的内向移动膜电流亦为NMDA电流,可能系内源性兴奋性氨基酸释放所致,也提示缺氧导致的NMDA电流幅度与缺氧前存在的兴奋性氨基酸水平密切相关。4 DHO对皮层神经元NMDA电流的影响无论在正常或缺氧条件下,不同浓度的DHO均能显著抑制皮层神经元的NMDA电流,并且随着DHO浓度(10-11~10-3mol/L)的不断升高,其电流密度逐渐减小,而抑制率则逐渐增大。当常氧灌流皮层神经元时,不同浓度DHO使NMDA电流密度依次降低为:7.081±0.798 pA/pF、7.064±0.909 pA/pF、6.290±0.677 pA/pF、5.097±0.909 pA/pF、4.18±1.104 pA/pF、3.606±1.027 pA/pF、3.045±0.583 pA/pF、2.003±0.68 pA/pF和1.672±0.548 pA/pF;其对NMDA电流的抑制率分别是:2.06%、2.30%、13.00%、29.50%、42.18%、50.13%、57.89%、72.29%和76.88%。当无糖低氧灌流时,DHO使NMDA电流密度分别降低到:10.033±0.459 pA/pF、9.772±0.531 pA/pF、8.808±1.019 pA/pF、7.254±0.998 pA/pF、6.401±0.649 pA/pF、6.054±0.724 pA/pF、5.737±0.616 pA/pF、5.169±0.666 pA/pF和4.978±0.495 pA/pF。其对NMDA电流的抑制率分别是:0.32%、2.91%、12.50%、27.94%、36.41%、39.85%、43.00%、48.64%和50.55%。以上数据提示,神经元钠钾泵参与了NMDA电流的调节,其功能强弱与NMDA电流大小密切相关。但在无糖低氧处理后,各浓度DHO孵育后的NMDA电流密度均较缺氧前明显增大,提示缺氧时神经元NMDA电流的调节可能主要取决于兴奋性氨基酸的释放而非钠钾泵的功能。5 Vanadate对皮层神经元NMDA电流的影响与DHO的作用相似,1μmol/L和1mmol/L的Vanadate也能显著抑制NMDA电流,其抑制率分别为49.25%和76.4%。进一步说明NMDA电流的调节与钠钾泵功能密切相关。6钠钾泵调节NMDA电流的机制研究DHO调节NMDA电流的量效关系曲线拟合结果显示,大鼠皮层神经元具有两种不同亲和力的钠泵,即高亲和力泵和低亲和力泵。常氧灌流时的拟合参数是:kh=3. 8143×10-9,kl=1.3671×10-5,fh=0.5839,fl=0.4161;缺氧情况下是:kh=2.3311×10-9,kl=1.1735×10-5,fh=0.7353,fl=0.2647。通过对拟合曲线的分析,发现钠泵的高低亲和力亚基均参与了DHO对NMDA电流的调节;缺氧前后高亲合力泵发生改变明显,而低亲合力泵改变不明显。神经元在孵育Na+/Ca2+交换体抑制剂KB-R7943(10μmol/L)后,NMDA电流密度由7.649±1.224pA/pF减小为7.102±1.226pA/pF,并未发生显著改变(P>0.05);而在灌流酪氨酸激酶抑制剂Genistein(100μmol/L)以后,NMDA电流密度由8.309±2.513pA/pF显著减小为2.173±1.412pA/pF(P<0.01),电流抑制率是74.81%,提示是钠泵的信号转导功能而不是其离子交换功能在NMDA电流的调节中发挥关键作用。结论:1缺氧可在皮层神经元引起NMDA电流,也可使皮层神经元NMDA电流显著增大,且引起或增大的电流密度具有明显的NMDA浓度依赖性。2无论在正常或缺氧条件下,DHO均能浓度依赖性显著抑制皮层神经元的NMDA电流,提示钠钾泵参与了神经元NMDA电流的调节,其功能强弱与NMDA电流大小密切相关。3缺氧可减小DHO对NMDA电流抑制作用,且主要改变Na+,K+-ATP酶的高亲和力α亚基相关参数,提示缺氧时神经元NMDA电流的调节可能主要取决于Na+,K+-ATP酶的高亲和力泵。4 Na+/Ca2+交换体抑制剂不影响NMDA电流密度,但酪氨酸激酶抑制剂可显著减小NMDA电流密度,提示是钠钾泵的信号转导功能而不是其离子交换功能在NMDA电流的调节中发挥关键作用。