论文部分内容阅读
乳腺癌是一种常见的恶性肿瘤，其发病率呈持续和明显上升的趋势。现已公认肿瘤是一种基因病，研究与恶性肿瘤相关的关键基因，不仅可以更加清楚的了解肿瘤的发生发展机制，而且为最终攻克癌症奠定坚实的理论基础。FEZ1／LZTS1基因是1999年Ishii等在8p22克隆出的一个新的抑癌基因。FEZ1／LZTS1基因在许多正常组织中普遍表达，但多项研究表明该基因在50％以上的肿瘤细胞中有改变，说明FEZ1／LZTS1基因可能在多种肿瘤的发生发展中起作用，值得关注的是Ishii等曾报道FEZ1／LZTS1基因在15例乳腺癌细胞系及10例原发性乳腺癌中均不表达，说明该基因的改变与乳腺癌有更加重要的关系。但是作为抑癌基因的FEZ1／LZTS1基因的失活机制尚未阐明。传统观点认为抑癌基因的失活是由基因突变、染色体缺失而导致的，但是多项研究表明FEZ1／LZTS1基因在多种肿瘤中突变罕见，说明突变可能并不是FEZ1／LZTS1基因失活的主要机制。近年来作为表遗传学最常见事件的DNA异常甲基化已成为研究基因沉默的焦点。因此本研究从FEZ1／LZTS1基因及其蛋白在乳腺癌中的表达入手，深入阐述FEZ1／LZTS1基因在乳腺癌发生发展中的作用，并对该基因启动子区域的甲基化状态进行检测。第一部分FEZ1／LZTS1基因mRNA在乳腺癌组织中的表达材料和方法：新鲜冻存乳腺癌组织及每个病例相应的癌旁正常组织各50例，分别提取癌组织和相应正常组织总RNA，采用RT-PCR方法检测FEZ1／LZTS1基因mRNA的表达。结果：1．50例乳腺癌组织中FEZ1／LZTS1基因mRNA表达缺失7例(14％)，表达下降23例(46％)，表达正常20例(40％)；而相应50例正常乳腺组织FEZ1／LZTS1基因mRNA全部表达。乳腺癌组织与正常乳腺组织相比FEZ1／LZTS1基因mRNA的表达明显下调，差异有显著性(P=0.000)。2．乳腺癌组织FEZ1／LZTS1基因mRNA表达的缺失／下降与淋巴结转移显著相关，即FEZ1／LZTS1基因mRNA表达缺失／下降组淋巴结转移明显高于FEZ1／LZTS1基因mRNA表达正常组，差异有统计学意义(P=0.032)。小结：1．FEZ1／LZTS1基因在原发性乳腺癌组织中明显发生改变，说明FEZ1／LZTS1基因在乳腺癌的发生发展中起重要作用。2．FEZ1／LZTS1基因mRNA表达的缺失／下降可能促进乳腺癌细胞的浸润转移。第二部分Fez1／Lzts1蛋白在乳腺癌组织中的表达及其与FEZ1／LZTS1基因mRNA表达的关系实验一．Fez1／Lzts1蛋白在乳腺癌组织中的表达材料和方法：运用免疫组织化学法(SP法)对100例石蜡包埋乳腺癌标本Fez1／Lzts1蛋白的表达进行检测。结果：1．Fez1／Lzts1蛋白在正常乳腺导管上皮中全部表达，蛋白定位于胞浆，呈棕黄色颗粒状。2．100例乳腺癌中，72例(72％)Fez1／Lzts1蛋白表达缺失和／或下降；其中28例强阳性(+)，29例中度阳性(+／-)，29例弱阳性(-／+)，14例阴性(-)；88例浸润性导管癌(IDC)中，65例(73.9％)Fez1／Lzts1蛋白表达缺失和／或下降，其中23例强阳性(+)、25例中度阳性(+／-)、26例弱阳性(-／+)及14例阴性(-)。3．Fez1／Lzts1蛋白表达的缺失／下降与淋巴结□移显著相□□□＜0．05)，尤其是Fez1／Lzts1蛋白表达阴□(-)组及弱阳性(-／+)组淋巴结转移率明显高于强阳性(+)及中度阳性(+／-)组，差异有统计学意义(P＜0.05)。4．FEZ1／LZTS1基因mRNA与Fez1／Lzts1蛋白表达具有显著的相关性(P=0.000)。实验二．FEZ1／LZTS1基因编码区突变的检测材料和方法：新鲜冻存乳腺癌组织2例，提取癌组织DNA，采用PCR-测序方法对FEZ1／LZTS1基因编码区的突变进行检测。结果：在2例中均发现相同位点的3个点突变，分别为：1．第912位碱基G→A突变；2．第1516位碱基A→G突变；3．第1992位碱基T→C突变。第912位及第1992位碱基突变为无义突变；第1516位碱基突变导致第468位的氨基酸残基天冬酰胺(N)转变为天门冬氨酸(D)。小结：1．Fez1／Lzts1蛋白在原发性乳腺癌组织中明显发生改变，这种改变可能主要发生在乳腺癌的进展期。2．Fez1／Lzts1蛋白表达的缺失／下降可能促进乳腺癌细胞的浸润转移，尤其是Fez1／Lzts1蛋白表达的细胞数小于50％时更有意义。3．FEZ1／LZTS1基因mRNA与Fez1／Lzts1蛋白表达显著相关。4．FEZ1／LZTS1基因编码区第1516位碱基A→G突变可导致氨基酸的改变，其意义有待于进一步研究。第三部分乳腺癌细胞系中FEZ1／LZTS1基因启动子区域甲基化状态材料和方法：提取11例乳腺癌细胞系DNA，运用重亚硫酸盐处理基因组DNA-PCR扩增-直接测序的方法对FEZ1／LZTS1基因启动子区域的甲基化状态进行检测。结果：11例乳腺癌细胞系中10例(90.91％)发现FEZ1／LZTS1基因启动子区域存在甲基化。在一共28个可能发生甲基化的CpG岛的5’胞嘧啶(C)位点，每个位点均至少在一个细胞系中发生了甲基化，甲基化频率为0％～100％，平均甲基化频率为65.26％。小结：乳腺癌细胞系中FEZ1／LZTS1基因启动子区的甲基化程度非常高，平均甲基化频率为65.26％。结论：1．FEZ1／LZTS1基因及其蛋白在乳腺癌的发生发展中起重要作用。2．FEZ1／LZTS1基因mRNA及其蛋白表达的缺失／下降可能促进乳腺癌细胞的浸润转移。3．乳腺癌细胞系中FEZ1／LZTS1基因启动子区域的甲基化程度非常高。