苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Ac MNPV）是杆状病毒的模式种,晚期表达因子LEF-10对病毒的复制是必需的,但其功能及调控机制尚不清楚。先前研究表明,LEF-1 0 蛋白具有朊病毒特性,是一个由杆状病毒编码的朊病毒。当LEF-10第21位的氨基酸残基由亮氨酸残基突变为丙氨酸残基后,显著影响其朊病毒状态并上调病毒晚期基因的表达。先前的酵母双杂交实验证实LEF-10与LEF-6、LEF-12和P47之间存在相互作用。本研究共分为两部分,第一部分采用荧光显微镜和流式细胞仪检测一系列LEF-1 0 突变体对LEF-1 0功能及其朊病毒状态的影响;第二部分通过AC-Seq、Pulldown和Bi FC技术,对LEF-10的功能进行探究。第一部分,本研究首先构建了异位回补突变体LEF-10的重组杆状病毒lef-10^L21XBacmid,其中LEF-10的第21位氨基酸残基饱和突变为其它19种氨基酸残基。重组病毒转染昆虫细胞后,只有野生型、L21I、L21V、L21F、L21C、L21M、L21A七种重组病毒能产生有感染性的子代病毒粒子。同时,本研究构建了原位突变LEF-10的重组杆状病毒Bacmid lef-10^L21X,重组病毒中只有野生型、L21I、L21V、L21F、L21C、L21M、L21A能够产生有感染性的子代病毒粒子。异位回补实验与原位突变实验结果一致,提示LEF-10的第21位氨基酸残基对LEF-10的结构及功能具有重要意义,并且只有异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸和丙氨酸六种氨基酸残基能够功能性替代亮氨酸残基。通过流式细胞术分析上述7种原位突变重组杆状病毒对晚期基因表达的影响,结果显示当以高MOI感染Sf9细胞时只有L21A、L21F、L21C和L21I四种重组杆状病毒的晚期基因表达量维持在较高水平。随后,本研究构建了LEF-1 0 在杆粒上过表达的重组杆状病毒Bacmid p（Chi A）lef-1 0^WT/L21A,将该病毒以高MOI感染Sf9细胞,病毒晚期基因获得更高的表达量,这与本课题组的前期报道相符。第二部分,通过亲和层析纯化获得与LEF-10互作的DNA,测序结果未能确定LEF-1 0 结合的具体DNA序列,但两次重复实验中测序结果高度一致,提示这可能存在一定的生物学意义。随后本研究以LEF-6、LEF-12和P47分别与GST融合表达作为诱饵蛋白进行Pulldown实验,结果表明上述三种GST融合蛋白与LEF-10-His均无相互作用。然而,Bi FC结果显示LEF-10与LEF-6、LEF-12和P47之间存在相互作用。Bi FC实验结果可以与酵母双杂交实验实验结果互相印证,提示LEF-10与LEF-6、LEF-12和P47之间可能存在潜在的相互作用。综上所述,本研究证明LEF-10高度保守的第21位氨基酸残基对LEF-10功能具有重要意义,该位点的疏水氨基酸残基替换能够较好地保持LEF-10的功能。LEF-10^L21A突变型能在高MOI感染下一定程度解除LEF-10的朊病毒状态,并上调杆状病毒晚期基因的表达。本研究为LEF-10的功能研究奠定了基础,为进一步优化杆状载体表达载体提供了新思路。