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牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea,BVD)又称为粘膜病(Mucosal disease,MD),是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起,临床症状主要为精神沉郁、流涎、产奶量下降甚至停奶、腹泻和结膜炎等,孕牛出现流产、产出畸形胎儿或产出持续感染(PI)牛,新生犊牛因严重腹泻而死亡。PI牛一生持续带毒并不断持续向外界排毒,是BVDV最主要的传染源。牛病毒性腹泻流行范围广,给全球养牛业造成了巨大的损失。BVDV的E0蛋白是最保守的结构蛋白之一,能被分泌到细胞外,样品不用做任何处理就能用抗原捕获ELISA(ACE-ELISA)检测,具有重要的诊断价值;E2是BVDV的主要保护性抗原;p80蛋白结构保守,针对p80的单抗能区分出动物是疫苗免疫还是自然感染的,可以用于鉴别诊断,有利于BVDV的净化。目前国外开发的抗原捕获ELISA(ACE)具有良好的敏感性、特异性和可重复性,可以用于检测BVDV的抗原,是一种操作简单且经济的可以检测PI牛的方法。目前我国尚缺乏可用的特异性良好的针对BVDV的p80、E0及E2蛋白的单克隆抗体,亦无自主研发的检测BVDV抗原的试剂盒,因此急需开展相关的研究。本研究利用MDBK细胞大量培养BVDV致细胞病变型毒株VEDEVAC和非致细胞病变型毒株3877,通过PEG浓缩和蔗糖密度梯度离心法纯化病毒作为免疫原,免疫Balb/c小鼠,通过间接ELISA和间接免疫荧光(IFA)进行阳性杂交瘤细胞的筛选。经过3次亚克隆后,获得7株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1E3、2C3、3F5、1B7、2B10、3E10、1B12。IFA结果表明这7株杂交瘤细胞分泌的单抗具有良好的特异性。免疫印迹试验结果表明其中4株单抗(2B10、1B7、3F5与3E10)为构象型表位,其余3株(1E3、2C3、1B12)为线性表位。间接免疫荧光(IFA)结果表明3E10是针对E2蛋白的单抗,3F5是针对P80蛋白的单抗。同时利用制备的单克隆抗体3E10和3F5作为捕获抗体,将辣根过氧化物酶(HRP)标记的1B12作为检测抗体,初步建立了双抗夹心ELISA。特异性反应实验表明该法不与MDBK细胞产生反应,亦不与牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)等其它牛呼吸道疾病病原反应,只针对BVDV。综上所述,本研究成功制备了7株BVDV单抗,其中4株单克隆抗体(2B10、1B7、3F5与3E10)针对的抗原表位为构象型表位,3株(1E3、2C3、1B12)为线性表位;其中3E10是针对E2蛋白的单抗,3F5是针对P80蛋白的单抗。同时,选择3E10和3F5作为捕获抗体,将HRP标记的1B12作为检测抗体,初步建立了双抗夹心ELISA方法,可试用于检测BVDV,为国内BVDV的检测提供了技术支撑。