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副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是猪上呼吸道的一种共栖菌,以多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要特征。外膜蛋白P2(Omp P2)是HPS外膜中最丰富的蛋白,能诱导宿主的炎症反应。序列分析发现HPS Omp P2蛋白表面由8或9个表面环状结构(loop)组成,推测loop(s)参与了Omp P2诱导的炎症反应。本研究以HPS强毒SC096菌株Omp P2和Omp P2 loops L1-L8为研究对象,体外刺激猪肺泡巨噬细胞(PAMs),检测loop诱导的细胞因子的种类和表达水平,研究loop肽段在Omp P2诱导炎症反应中的作用;通过分析TLR/NF-κB和MAPK通路中关键蛋白分子的表达,探索loop肽段在Omp P2诱导炎症反应中的分子机制。取得的结果如下:1.loops L7和L8参与HPS Omp P2诱导细胞因子的表达为了研究OmpP2和OmpP2 loops L1-L8能否诱导细胞因子的表达,我们通过提取HPS Omp P2以及合成Omp P2 loops L1-L8刺激PAMs,分别在刺激6 h和12 h后收集样本进行Real-time PCR。结果发现用5μg/m L和10μg/m L的HPS Omp P2刺激能引起IL-1α,IL-1β,IL-6,IL-8,IL-17,IL-23,CCL-4和CCL-5 m RNA转录水平的显著上调(P<0.05或P<0.01)。当用130 nmol/m L和260 nmol/m L的loops L1-L8刺激后,细胞因子的m RNA转录水平均有不同程度的上调,其中loops L7和L8刺激后以时间依赖和剂量依赖性方式显著上调细胞因子m RNA的表达(P<0.05或P<0.01)。当260 nmol/m L的loop L7刺激PAMs 12 h后,IL-1α和IL-6 m RNA转录水平分别上调8.8倍,7.5倍。当260 nmol/m L的loop L8刺激PAMs 6 h时,IL-17 m RNA转录水平上调8.5倍。当刺激12 h后,IL-8 m RNA转录水平上调7.2倍;IL-23 m RNA转录水平升高7.4倍。以上结果表明在8个loops中,loops L7和L8是主要参与HPS Omp P2诱导细胞因子表达的肽段。为了验证loops L7和L8诱导IL-6和IL-8蛋白表达,我们用10μg/m L的HPS Omp P2,260 nmol/m L的loops L7和L8刺激PAMs,12 h后收集细胞上清液,通过ELISA检测试剂盒检测IL-6和IL-8细胞因子蛋白的表达量。结果显示loops L7和L8刺激后IL-6和IL-8蛋白表达量显著上调(P<0.05或P<0.01)。当loop L7刺激时,IL-6和IL-8蛋白表达水平分别升高5.6倍和5.8倍;当loop L8刺激时,IL-6和IL-8蛋白表达水平分别升高5倍和3.4倍。说明loops L7和L8参与了HPS Omp P2诱导细胞因子蛋白的表达。为了进一步确定loops L7和L8参与HPS Omp P2诱导细胞因子表达,我们构建了omp P2ΔLoop7和omp P2ΔLoop8突变菌株,并提取了缺失株的Omp P2来刺激PAMs,分别刺激6 h和12 h后收集样本进行Real-time PCR。与Omp P2刺激相比,omp P2ΔLoop7-Omp P2和omp P2ΔLoop8-Omp P2诱导细胞因子m RNA的表达量以时间依赖性方式和剂量依赖性方式明显减少(P<0.01)。当omp P2ΔLoop7-Omp P2和omp P2ΔLoop8-Omp P2以5μg/m L或者10μg/m L的浓度刺激PAMs 6 h或12 h时,诱导IL-1α,IL-1β,IL-6,IL-8,IL-17,IL-23,CCL-4和CCL-5 m RNA的转录水平仅为HPS Omp P2刺激组的10%~50%。这个结果进一步说明loops L7和L8在HPS Omp P2诱导细胞因子的表达过程中起重要的作用。通过比对HPS 15个血清型Omp P2的loops L7和L8的氨基酸序列。结果发现loops L7和L8的氨基酸序列在HPS强毒力的参考菌株中相对保守,说明loops L7和L8是Omp P2蛋白中最保守的肽段。因此,loops L7和L8作为HPS Omp P2中最保守、最活跃的肽段,能够诱导PAMs中细胞因子的表达,在HPS Omp P2感染引起炎症反应过程中发挥着重要作用。2.loops L7和L8参与HPS Omp P2诱导激活TLR/NF-κB和MAPK信号通路为了验证loops L7和L8在参与HPS Omp P2诱导炎症反应过程中激活了NF-κB和MAPK信号通路,我们分别将荧光素酶报告质粒p NF-κb-Luc和p AP-1-Luc转染PAMs,同时共转染内参质粒p RL-TK。转染24 h后,分别用5μg/m L和10μg/m L的HPS Omp P2,130 nmol/m L和260 nmol/m L的loop L7,L8以及乱序肽刺激细胞12 h后,进行双荧光素酶报告系统分析。与对照组相比,HPS Omp P2,loops L7和L8刺激PAMs 12 h后,NF-κB和AP-1的荧光素值以剂量依赖性方式显著增加(P<0.01)。当10μg/m L的HPS Omp P2刺激细胞时,诱导的NF-κB和AP-1荧光值的表达量分别升高22倍和13倍(P<0.01)。当260 nmol/m L的loops L7和L8刺激细胞时,NF-κB荧光值的表达量分别升高25倍和23.5倍(P<0.01);AP-1荧光值的表达量分别升高15倍和12倍(P<0.01)。以上结果说明loops L7和L8在HPS Omp P2诱导炎症反应过程中参与激活NF-κB和MAPK信号通路。已知HPS的模式识别受体主要有TLR1、TLR2、TLR4、TLR5和TLR6,为了进一步研究哪些TLR受体参与识别loops L7和L8激活NF-κB和MAPK信号通路,我们将干扰分子和荧光素酶报告质粒共同转染细胞24 h后,用5μg/m L的HPS Omp P2,130 nmol/m L的loop L7和L8刺激细胞12 h后,进行双荧光素酶报告系统分析。结果发现转染了psi TLR1、psi TLR2、psi TLR4和psi TLR6细胞的NF-κB和AP-1荧光值水平明显下调(P<0.01)。当转染psi TLR4时,loop L7诱导的NF-κB和AP-1荧光值下调最大(P<0.01),分别下调4.3倍和3倍。loop L8诱导的AP-1的荧光值下调最大(P<0.01),下调1.9倍。以上结果说明loops L7和L8在HPS Omp P2诱导炎症反应过程中通过TLR1,TLR2,TLR4和TLR6途径参与激活NF-κB和MAPK信号通路。为了了解loops L7和L8在HPS OmpP2诱导NF-κB和MAPK信号通路的过程中参与激活了哪些信号通路相关蛋白,我们利用Western blot方法检测ERK,JNK,p38和p65蛋白的表达量。与对照组相比,10μg/m L的HPS Omp P2刺激PAMs后,phospho-ERK和phospho-p65的磷酸化水平在作用0.5 h时达到最高值,分别升高1.5倍和2.7倍(P<0.01)。phospho-JNK的磷酸化水平在作用3 h时达到最高值,升高1.5倍(P<0.01)。phospho-p38的磷酸化水平在作用1 h时达到最高值,升高3倍(P<0.01)。260 nmol/m L的loop L7刺激PAMs 0.5 h后phospho-p65的磷酸化水平显著上调(P<0.05),升高1.4倍。phospho-JNK的磷酸化水平在作用3 h后达到最高值,升高1.3倍(P<0.05)。260 nmol/m L的loops L7和L8作用3 h后phospho-p38的磷酸化水平达到最高值,分别升高2.3倍和2.4倍(P<0.01)。结果说明HPS Omp P2诱导炎症反应过程中,loop L7通过p65,p38和JNK途径参与激活NF-κB和MAPK信号通路,loop L8通过p38途径参与激活NF-κB和MAPK信号通路。将p65和JNK抑制剂作用于PAMs后,我们利用Western blot方法检测JNK和p65蛋白的表达量。与对照组相比,HPS Omp P2和loop L7诱导的phospho-ERK和phospho-p65磷酸化水平显著下调(P<0.05或P<0.01)。其中10μg/m L的Omp P2刺激细胞1 h,诱导的phospho-ERK磷酸化下调最高,下调25.8倍。260 nmol/m L的loop L7刺激细胞0.5 h后,诱导的phospho-ERK磷酸化水平下调最高,下调16.7倍。接着我们通过Real-time PCR方法检测loop L7诱导的细胞因子转录水平的变化。结果发现加入抑制剂作用后,细胞因子m RNA的转录水平显著下调(P<0.05或P<0.01)。在ERK抑制剂作用后,当loop L7以260 nmol/m L浓度刺激细胞1 h后,细胞因子m RNA的转录水平在对照组诱导的m RNA转录水平的30%以下。在p65抑制剂作用后,当260 nmol/m L的loop L7刺激细胞1 h后,细胞因子m RNA的转录水平下调至少50%。结果表明loop L7通过p65和JNK途径激活NF-κB和MAPK信号通路,从而诱导细胞因子IL-1α,IL-8,IL-17和CCL-4的转录。